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光敏性皮肤病,是由紫外线照射引起的,以日光暴露部位出现红斑、水肿或多形性皮损,自觉灼热瘙痒为临床表现的常见性、多发性皮肤病,中医称之为“日晒疮”。紫外线照射造成皮肤角质形成细胞的损伤是光敏性皮肤病发病的关键环节。蒿秦化斑方,方含青蒿、秦艽、丹皮、赤芍等8味中草药,具有清热凉血解毒之功效,在临床应用中具有较好的疗效,目前国内外未见其保护角质形成细胞免受紫外线损伤的基础研究。本研究通过建立中波紫外线辐射损伤人永生化上皮角质形成细胞(HaCaT细胞)的病理模型,目的是模拟中波紫外线(UVB)辐射损伤的入永生化上皮角质形成细胞,探究蒿秦化斑方对中波紫外线诱导的HaCaT细胞的损伤有无保护作用并探讨其可能作用机制,丰富清热凉血解毒法治疗光敏性皮肤病的科学内涵。研究目的建立UVB辐射损伤HaCaT细胞的病理模型,并探讨蒿秦化斑方对HaCaT细胞光损伤的保护作用机制,为“清热凉血解毒”之法有效治疗光敏性皮肤病提供科学依据。研究方法1.细胞培养用含有10%胎牛血清的1640培养基培养HaCaT细胞,待细胞密度增加至80%以上时,收集细胞,定量接种于培养皿或96孔细胞培养板中。2.细胞毒性的测定用不同剂量的蒿秦化斑方培养基作用HaCaT细胞一定时间,MTT法检测细胞增殖,计算不同剂量药物对HaCaT细胞的抑制率,选择细胞抑制率小于10%的剂量作为最大无毒剂量。3.UVB照射与分组根据最大无毒浓度确定高、中、低三种不同剂量的蒿秦化斑方,根据实验设计以300mJ/cm2UVB照射HaCaT细胞,并于照射后分别加入高、中、低剂量蒿秦化斑方进行干预。取正常培养的细胞作为空白对照组,UVB照射后未经药物干预的作为UVB模型组。4.蒿秦化斑方对HaCaT细胞增殖活性的影响MTT法检测细胞增殖。5.蒿秦化斑方对HaCaT细胞氧化损伤的影响吸光度法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)的含量。6.蒿秦化斑方对HaCaT细胞炎症反应的影响ELISA法检测内皮细胞-白细胞黏附分子-1(ELAM-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生子因子β(TGF-β)的含量。Real Time PCR法检测ELAM-1、ICAM-1、VCAM-1、IL-10、TGF-β的基因相对表达水平。研究结果1.细胞毒性测定与细胞分组对细胞毒性的测定发现,1.25%中药对细胞活性抑制率最低,对应的中药浓度为12.1 mg/mL,因此可以确定中药最大无毒剂量为。实验细胞分为五组:空白组、UVB模型组、蒿秦化斑方高剂量组(中药浓度为12.1 mg/mL)、蒿秦化斑方中剂量组(中药浓度为6.05 mg/mL)、蒿秦化斑方低剂量组(中药浓度为3.03mg/mL)。2.蒿秦化斑方对HaCaT细胞增殖活性的影响与空白组比较,UVB模型组HaCaT细胞增殖活性明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与UVB模型组比较,蒿秦化斑方高、中、低剂量组HaCaT细胞增殖活性均明显增强,差异具有统计学意义(P<0.01),说明对于UVB辐射导致的细胞增殖活性降低,高、中、低剂量蒿秦化斑方均能够提高细胞增殖活性对其起到一定程度的逆转作用。3.蒿秦化斑方对HaCaT细胞氧化损伤的影响与空白对照组比较,UVB模型组SOD表达降低(P<0.05);与UVB模型组比较,蒿秦化斑方高剂量组SOD表达增多(P<0.05),提示高剂量蒿秦化斑方能够增强SOD活性。与空白对照组比较,UVB模型组分解1 μ mol的H2O2所需的CAT量升高,提示CAT活性明显降低(P<0.01);与UVB模型组比较,蒿秦化斑方高剂量组分解1 μ mol的H2O2所需CAT量减少,说明高剂量的蒿秦化斑方干预后CAT活性增强(P<0.05)。与空白对照组比较,UVB模型组MDA含量显著增加(P<0.01);与UVB模型组比较,蒿秦化斑方高剂量组MDA含量显著降低(P<0.01),显示出了高剂量蒿秦化斑方对于MDA的影响。表明高剂量蒿秦化斑方对UVB导致的氧化损伤有一定程度改善作用。4.蒿秦化斑方对HaCaT细胞炎症反应的影响通过ELISA法对炎症相关因子含量的检测显示,与空白对照组比较,UVB模型组 ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1、IL-10 含量均增加(P<0.05),TGF-β 含量表达降低(P<0.05),表明UVB照射能够诱发炎症反应;与UVB模型组比较,蒿秦化斑方高剂量组ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1、IL-10的含量均降低(P<0.05),TGF-β含量升高(P<0.05),表明高剂量蒿秦化斑方能够有效减轻UVB照射诱导的炎症反应。RT-PCR的结果显示,与空白组比较,UVB模型组ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1和IL-10的基因转录水平均升高,TGF-β基因转录水平降低(P<0.05);与模型组比较,蒿秦化斑方高、中、低剂量组ICAM-1和IL-10基因相对表达均降低(P<0.05),蒿秦化斑方高、中剂量组VCAM-1和ELAM-1基因相对表达均降低(P<0.05),蒿秦化斑方低剂量组TGF-β基因相对表达升高(P<0.05)。结论UVB辐射能够导致HaCaT细胞增殖活性下降,能够诱发HaCaT细胞氧化损伤和炎症反应。蒿秦化斑方能够通过增强抗氧化酶SOD、CAT的活性及减少脂质过氧化物MDA的产生抑制UVB诱导的HaCaT细胞氧化损伤,能够通过降低HaCaT细胞中粘附因子(ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1)和IL-10的表达抑制UVB诱导的HaCaT细胞的炎症反应,通过增强细胞增殖活性和上调促纤维化因子TGF-β的表达修复皮肤屏障功能,蒿秦化斑方能从以上三个方面对UVB诱导的HaCaT细胞光损伤起到保护作用。蒿秦化斑方是在“光毒郁肤”理论基础上以“清热凉血解毒”为核心治法创立的,传统中医总结的清热凉血解毒法之法是防治光敏性皮肤病的有效治法,本研究证实了这一理论的可靠性和科学依性。