甜橙响应柑橘溃疡病菌调控的糖转运基因筛选与鉴定

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hongguoqwer
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柑橘溃疡病是严重危害柑橘产业发展的重要细菌病害之一,可侵染几乎所有柑橘栽培品种,目前尚无根治方法。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp citri,Xcc)通过气孔或伤口等侵入寄主后,在植物细胞间隙(质外体)定殖,从寄主细胞中获取营养用于生长繁殖。其中来源于植物寄主光合作用的糖类物质是Xcc繁殖的主要能量来源,但糖类物质在植物细胞内合成,位于细胞间隙的Xcc需要调控寄主糖转运蛋白将胞内的糖类物质转运到胞外,从而加以利用。糖转运蛋白对于病原菌在寄主内生长繁殖至关重要,不同病原菌调控寄主的糖转运蛋白种类和途径均有差异,有关Xcc调控感病种质糖转运蛋白的研究较少,调控途径尚不明确,因此弄清Xcc入侵过程中调控糖转运蛋白途径对溃疡病抗病育种至关重要,筛选并获得沉默植物体内的关键糖转运蛋白的转基因可能是未来可持续发展的育种方向。本研究拟以感病种质冰糖橙为材料及抗病种质枸橼C-05为对照,基于转录组水平筛选受Xcc诱导显著高表达的糖转运蛋白,利用qRT-PCR验证和糖转运候选基因超表达的抗感性分析,主要研究结果如下:(1)根据糖转运蛋白的保守结构域筛选鉴定出119甜橙糖转运蛋白,其中SWEETs家族20个、7个SUTs家族、42个MSTs家族及50个MFSs家族其它糖转运基因;进一步利用前期完成的在冰糖橙和枸橼C-05接种Xcc不同时间点的转录组测序分析甜橙119个糖转运基因表达变化,结果显示,SWEET2a、SUT2、Cs3g06440、STP6和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导特异上调表达;Cs9g10540和SWEET12b在枸橼C-05中受Xcc诱导特异上调表达。(2)进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证7个糖转运候选基因在冰糖橙和枸橼C-05叶片中受Xcc诱导的表达特征。结果显示STP6在冰糖橙和枸橼C-05中均显著上调表达;SWEET2a及SUT2在冰糖橙中显著上调表达,而在枸橼C-05中表达无显著变化,且SWEET2a和SUT2在冰糖橙叶片接种Xcc后第4天表达量达到最高峰,此时冰糖橙叶片上接种Xcc区域开始出现水渍状病斑,结果表明SWEET1a和SUT2的表达与柑橘溃疡病症状的形成密切相关。(3)分析不同柑橘种质SWEET2a、STP6及SUT2同源基因编码的氨基酸序列和启动子顺式作用元件,发现3个糖转运基因在不同柑橘种质中编码的氨基酸序列和启动子顺式作用元件存在较大差异。经氨基酸序列比对发现,冰糖橙、枸橼C-05、柚、长果香橼、普通枸橼和金柑的SWEET2a、STP6及SUT2分别存在13、19和8处突变位点。其中冰糖橙SWEET2a有2处特异位点(M190V、V211L)、SUT2有1处特异位点(L211Y)、STP6有2处特异位点(V500A、R515S)。启动子顺式作用元件的预测结果显示,冰糖橙SWEET2a含有特异的顺式作用元件TCA-element、TC-rich repeats和ABRE,枸橼C-05SWEET2a存在特异顺式作用元件O2-site、GCN4-motif、TGACG-motif和TATC-box;冰糖橙SUT2含有特异顺式作用元件motifⅠ,枸橼C-05 SUT2无特异顺式作用元件;冰糖橙STP6含有特异顺式作用元件LTR,枸橼C-05 STP6存在特异顺式作用元件O2-site和TCA-element。以上3个糖转运基因在感病种质冰糖橙中的这些氨基酸差异位点及启动子顺式作用元件可能是Xcc特异调控这些糖转运蛋白的原因。(4)烟草叶片瞬时表达结果显示,CsSUT2、CsSWEET2a和CsSTP6主要定位在质膜上;冰糖橙和枸橼C-05叶片上瞬时超表达验证结果显示,4 dpi时CsSUT2、CsSTP6和CsSWEET2a超表达叶片区域的Xcc含量均显著高于p1300空载体对照P0,且15 dpi叶片症状比对照P0更明显,说明CsSUT2、CsSWEET2a和CsSTP6均能促进Xcc在柑橘叶片中定殖;将CsSUT2和CsSWEET2a超表达载体转入拟南芥中,获得超表达转基因T1代株系,并在野生型拟南芥(WT)和超表达株系(OE)上接种Pst.DC3000,结果显示,超表达CsSUT2和CsSWEET2a在3 dpi时,叶片中Pst.DC3000含量均显著高于WT,且症状比对照WT明显,表明CsSUT2和CsSWEET2a为受细菌调控的主要糖转运基因。
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