论文部分内容阅读
嗅觉是鱼类最重要的感觉之一,在其觅食、繁殖、洄游及同类识别等生命活动中扮演重要角色。团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国特有的植食性淡水养殖经济鱼类,但其植食性的机制尚不清楚。诸多研究表明,嗅觉可能是影响鱼类摄食的关键因素之一。然而有关鱼类嗅觉受体进化与食性之间的关系研究依旧较少。本研究以性成熟(2龄)的团头鲂为研究对象:借助形态学和组织学方法,观察团头鲂嗅觉器官的形态和超微结构;根据团头鲂三代基因组数据对其嗅觉受体基因家族进行鉴定、分类和进化研究;结合转录组测序和qRT-PCR分析,探究雌雄团头鲂嗅囊中嗅觉受体基因及免疫相关基因表达模式是否存在差异;通过荧光原位杂交技术对4个嗅觉受体(ORs)在团头鲂嗅囊中的表达部位进行研究,相关研究结果将为后续探究鱼类嗅觉及嗅觉受体基因功能奠定基础,并深化对鱼类嗅觉识别的认知。主要研究结果如下:1.团头鲂的嗅觉感受系统及嗅囊的组织学观察团头鲂的嗅觉感受系统主要由鼻孔、鼻腔和嗅囊组成,嗅囊位于鼻腔底部,呈椭圆形。团头鲂的嗅囊由嗅轴和嗅基板组成,嗅轴左右两侧共计44-48个嗅基板,垂直于嗅轴排列,属于G型。HE染色结果显示,嗅基板中央由疏松结缔组织和毛细血管构成中央髓;中央髓两侧是嗅上皮,主要分布有纤毛神经元、微绒毛神经元、隐窝神经元、支持细胞和基细胞。比较9种鱼类,包括团头鲂、翘嘴鲌、大口黑鲈、鳜、黄颡鱼、草鱼、鲫、泥鳅、大鳞副泥鳅和斑马鱼的嗅囊形态及组织学,结果表明,不同鱼类的嗅囊形态和嗅基板数量差异较大。扫描电镜结果显示,团头鲂的嗅基板呈叶子状,其中嗅基板外侧表面为感觉区,嗅基板边缘为非感觉区。感觉区主要有纤毛神经元和微绒毛神经元,纤毛长度为2.39-6.89μm,微绒毛的长度为0.63-1.72μm。将团头鲂的嗅囊与肉食性鱼类翘嘴鲌(Culter alburnus)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)对比发现,同属于鲤科鱼类的团头鲂和翘嘴鲌的嗅囊结构较为相似,均为G形,而鲈形目大口黑鲈的嗅囊呈F形。团头鲂和翘嘴鲌的嗅基板数目(分别为44-48和40-46个)远多于大口黑鲈(8-9个)。2.团头鲂嗅觉受体基因(ORs)的鉴定及进化分析基于团头鲂三代基因组数据,共鉴定出338个ORs,其中包括224个ORs、7个V1Rs、55个V2Rs和52个TAARs。基因结构分析发现,嗅觉受体基因属于G蛋白偶联受体(GPCRs),具有7次跨膜结构;三级结构和motif位点预测结果显示,m ORs的α螺旋处于跨膜区,β折叠处于非跨膜区,其保守性最高的6个位点均处于跨膜区。将团头鲂及其它6种鱼类的ORs用最大似然法构建进化树,结果显示鱼类的m ORs共有9种亚型,分别是:δ、ε、ζ、η、β、α、γ、κ和θ。与其它鱼类相比,团头鲂的β家族成员大量扩张,共有20个。团头鲂的V1Rs在进化上较为保守,V1R3有两个亚型,而V1R4缺失。鱼类的V2Rs可分为3类:GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ,共计17个亚型。其中,团头鲂的iv、ix、xvi三个亚型的成员较多,除绿河鲀和红鳍东方鲀存在多个亚型缺失,其它7种鱼类基因组均存在iv、vii、viii、v和xv亚型,团头鲂和斑马鱼中还存在特有的xvii亚型。3.雌雄团头鲂嗅囊中嗅觉受体基因和免疫相关基因表达模式研究基于RNA-Seq分别对雌雄团头鲂的嗅囊(雌雄各3个重复)进行转录组测序。通过注释总共产生30,272个蛋白质编码转录本。差异表达基因(DEGs)分析结果显示,雄性和雌性团头鲂的嗅囊中存在3,854个差异表达基因。KEGG富集结果显示,DEGs主要富集在与免疫和疾病相关的通路。团头鲂ORs在雌雄嗅囊中表达模式相似,仅有10个ORs(Delta24、Delta25、Delta58、Delta61、Delta37、V2R1、V2R4、V2R23、V2R27、TAAR31)表达量差异显著(P<0.05)。为了验证RNA-seq的结果,研究采用qRT-PCR对10个差异表达的ORs和6个差异表达的免疫基因(MHC1、MHC2、CRP、IGH)进行验证,结果表明这些基因的表达模式在RNA-seq和qRTPCR之间高度一致。研究利用荧光原位杂交技术对4个m ORs(Beta1、Beta12、Epsilon9和Eta28)的表达部位进行分析,结果显示这4个基因均在嗅基板底部嗅觉神经元中表达。