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背景:宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)是子宫性不孕最常见的原因。通常认为,宫腔操作等各种因素引起子宫内膜基底层损伤或创伤,炎性免疫细胞浸润受损部位,导致细胞外基质大量沉积,子宫内膜发生纤维化,最终形成宫腔粘连。可是,迄今关于宫腔粘连形成的具体机制尚不明确。因此,探索宫腔粘连的发生机制及治疗靶点,对于降低宫腔粘连发病率及改善女性生育功能至关重要。巨噬细胞不仅是宿主防御和炎症的重要组成部分,而且在伤口修复及纤维化过程中,巨噬细胞深刻地影响伤口愈合和疤痕形成。通常认为,巨噬细胞是一个异质性细胞群,根据其活化方式的不同可分为两类,即经典激活的促炎表型M1巨噬细胞和替代性激活的抗炎表型M2巨噬细胞。然而,目前研究认为仅将巨噬细胞分为促炎M1型和抗炎M2型不能准确地认识其功能和作用,因此越来越多的巨噬细胞新亚群及其功能不断被发现。已有研究报道,CX3CR1+巨噬细胞参与组织修复与纤维化进程,且存在于子宫内膜中。我们课题组前期研究发现,宫腔粘连患者内膜中M-CSF表达下降,CD163+巨噬细胞减少;测序结果显示,作为与M-CSF共用CSF-1R受体的免疫调节因子,IL-34在宫腔粘连患者子宫内膜中异常高表达。已知IL-34能够促进单核细胞的生长、增殖及向成熟巨噬细胞的分化;IL-34可通过调控巨噬细胞参与纤维化的进展;PI3K/Akt途径参与IL-34对巨噬细胞的作用。这些结果提示,IL-34可能通过调控巨噬细胞的表型和功能,参与子宫内膜的纤维化进程。可是,目前尚不清楚IL-34是否调控CX3CR1+巨噬细胞影响子宫内膜纤维化。目的:旨在探讨IL-34调控巨噬细胞表型和功能参与子宫内膜纤维化的具体机制。方法:1.利用实时定量荧光PCR(q RT-PCR)、蛋白质免疫印迹(western blot)、免疫组化及免疫荧光等技术,检测宫腔粘连患者及正常人子宫内膜组织IL-34的表达及CX3CR1+巨噬细胞的数量。2.体外探索IL-34对巨噬细胞表型和功能的调控作用及IL-34诱导的巨噬细胞对子宫间质细胞分化为肌成纤维细胞的影响。我们提取骨髓来源的单核细胞,分别用GM-CSF、M-CSF或IL-34诱导单核细胞的分化,流式细胞术及q RT-PCR法检测IL-34对巨噬细胞表达表面标志物的影响;利用CSF-1R抑制剂GW2580和PI3K/Akt抑制剂LY294002处理,检测IL-34对CSF-1R/PI3K/Akt通路的激活作用及对巨噬细胞表型的影响;利用IL-34诱导的巨噬细胞上清与原代小鼠子宫间质细胞共培,检测IL-34诱导的巨噬细胞对子宫间质细胞转分化为肌成纤维细胞的影响;利用流式细胞术分选IL-34诱导3天后的CX3CR1-和CX3CR1+的巨噬细胞,并与间质细胞共培,分析CX3CR1+巨噬细胞对间质细胞的转分化作用。3.建立小鼠短期(7天)和长期(28天)宫腔粘连模型,即以机械搔刮法+宫腔局部注射LPS作为阳性对照组,机械搔刮法+宫腔局部注射PBS作为阴性对照组,机械搔刮+宫腔局部注射IL-34作为实验组。收集子宫组织,采用苏木精-伊红(HE)染色、马松染色、免疫组化技术及q RT-PCR法,检测机械搔刮+宫腔局部注射IL-34对子宫内膜纤维化的具体影响;采用免疫组化、免疫荧光、western blot、流式细胞术及q RT-PCR法,分析IL-34对子宫和脾脏部位免疫细胞的调控作用。结果:1.宫腔粘连患者子宫内膜中IL-34和CX3CR1的m RNA水平及蛋白水平显著高于正常人;巨噬细胞CX3CR1的表达也显著高于正常人。2.IL-34诱导的原代巨噬细胞呈现CD86lowCD163highCX3CR1high表型,其类似M2样表型的巨噬细胞。CSF-1R抑制剂和PI3K/Akt抑制剂处理结果表明,IL-34可通过CSF-1R/P13K/Akt通路调控巨噬细胞的表型。进一步发现,与GM-CSF或M-CSF诱导的巨噬细胞上清相比,IL-34诱导的巨噬细胞上清可显著促进原代子宫间质细胞分化为肌成纤维细胞,特别是,IL-34诱导后分选的CX3CR1+巨噬细胞也促进间质细胞的转分化。3.短期模型的外形和HE染色结果表明,与搔刮+PBS组相比,搔刮+IL-34组与搔刮+LPS组表现相似的宫腔粘连形态及组织损伤,即子宫外观红肿、上皮细胞不连续和间质出血、水肿及白细胞浸润;长期模型的外形及组织学结果表明,搔刮+IL-34组与搔刮+LPS组都可显现子宫外观萎缩及间质区域腺体减少。进一步的马松染色结果表明,不论短期和长期模型中,搔刮+IL-34组和搔刮+LPS组都出现深蓝色的胶原纤维大量沉积;α-SMA的免疫组化染色表明IL-34对子宫内膜肌成纤维细胞的激活作用。值得注意的是,对子宫内膜的F4/80和CX3CR1的免疫组化和免疫荧光双染表明,IL-34不仅上调巨噬细胞、CX3CR1+细胞的数量,还上调CX3CR1+巨噬细胞的数量。此外,流式细胞仪分析结果显示,IL-34也能够改变脾脏组织中的巨噬细胞的比例。这些结果提示IL-34具有促进子宫内膜的纤维化作用,这种作用可能部分地归功于CX3CR1+巨噬细胞数量的增加。结论:IL-34参与宫腔粘连的纤维化发生,其作用机制可能是IL-34通过CSF-1R/PI3K/Akt通路诱导CD86lowCD163highCX3CR1high表型的M2样巨噬细胞增加;IL-34诱导的CX3CR1+巨噬细胞可促使子宫间质细胞转分化为肌成纤维细胞及其大量沉积细胞外基质,最终导致纤维化的形成。本研究为解释宫腔粘连的发生提供了新的机制。