蛋白质是生命体的基本组成成分,是维持生命正常生理功能的重要活性物质。蛋白质与营养代谢、物质运输、机能防御、遗传等生理活动密切相关。而且有研究表明,在疾病的发展过程中,一些特异性蛋白质的表达与分布也会发生改变,因此蛋白质的分析检测对掌握蛋白质的生理功能,研究蛋白质参与的生理活动以及相关疾病的诊断、治疗都具有重要意义。基于小分子配体和蛋白质之间的特异性相互作用的末端保护原理最近引起了蛋白质研究工作者的广泛兴趣。末端保护是指首先将小分子配体连接在DNA上,目标蛋白质与小分子配体结合后,能够阻止外切酶对连接小分子的DNA链进行消解。末端保护对DNA序列的编码无限制,可以与各种基于核酸的扩增技术和检测手段相结合,这为蛋白质分子的灵敏检测提供了新的途径。本论文基于小分子连接DNA末端保护原理建立了系列蛋白质荧光分析的方法,主要内容如下:方法一:基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的荧光信号降低法检测蛋白质。在本实验中,我们设计了一个发夹结构的DNA探针。探针3’端标记有生物素(biotin)。当目标蛋白质-链霉亲合素(STV)不存在时,核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)能够特异性地从3’端水解DNA探针的双链部分。未被水解的探针的单链部分能够形成DNA酶(DNAzyme)结构。DNAzyme与加入的分子信标结合,在中间的RNA碱基处将分子信标切断。分子信标上的荧光基团和猝灭基团因此而分离,荧光信号恢复。之后,DNAzyme又与新的分子信标结合,发生剪切作用,释放荧光基团。DNAzyme不断循环利用,直至全部的分子信标参与反应,荧光信号达到最强。加入目标蛋白质STV后,STV与biotin特异性结合,能够阻止ExoⅢ从3’端水解DNA探针的双链部分。DNA探针仍然保持发夹结构,无法形成DNAzyme。没有DNAzyme的作用,分子信标不能被切断,保持荧光猝灭状态。该方法通过荧光信号的降低对目标蛋白质进行定量测定,可以检测到低至50 pmol的STV。方法简单快速,检测成本低,但灵敏度还有待于进一步提高。方法二:基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的荧光信号放大法检测蛋白质。在本实验中,我们将与小分子连接的DNA探针设计成DNAzyme的序列。目标蛋白质与小分子结合后,末端受到蛋白质保护,核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)不能消解DNA探针。DNA探针保持DNAzyme结构,与加入的分子信标结合,切断分子信标,释放荧光信号。DNAzyme不断循环利用,与新的分子信标结合,发生剪切反应,释放出越来越多的荧光基团,产生越来越强的荧光信号。当没有目标蛋白质出现时,DNA探针被ExoⅠ水解,DNAzyme结构消失,加入的分子信标保持淬灭状态,体系荧光信号很弱。通过检测荧光信号的增长来实现目标蛋白质的定量检测。我们将该方法分别应用于链霉亲和素(STV)和叶酸受体(FR)的检测,取得了良好的效果。该方法可以检测到低至0.1 pmol的STV和100 ng的FR,灵敏度比方法一提高了500倍。