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研究背景：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种病变累及多系统、多器官,严重危害人类健康的自身免疫性疾病。然而SLE确切的病因及发病机理尚不明确。越来越多的研究表明表观遗传机制,特别是DNA低甲基化在调控T细胞自身免疫相关基因表达及SLE发病中起着十分重要的作用。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控。DNA甲基化是重要的表观遗传学机制之一,在胚胎发育、基因印迹、X染色体失活、调节基因的表达及DNA与蛋白质之间的相互关系、染色质结构改变等方面发挥重要作用。已有研究表明在体外抑制T细胞DNA甲基化,可使T细胞甲基化敏感基因调控序列特定区域低甲基化,从而导致基因过度表达。这些基因包括CD11a (ITGAL)、perforin (PRF1)、CD70 (TNFSF7)及CD40 ligand(TNFSF5)。研究发现,SLE患者外周血CD4+T细胞中CD11a、CD70等基因表达异常升高。而过度表达这些基因的T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或辅助B细胞产生大量的自身抗体,在动物体内能诱导狼疮样疾病。目前研究已证实CD70和CD11a等基因过度表达是导致T淋巴细胞异常活化和系统性红斑狼疮(SLE)发病的重要机制之一,然而上述基因过度表达的分子机制尚未完全阐明。我们通过转录因子活性谱芯片检测发现SLE患者CD4+T细胞中存在多个具有差异活性的转录因子,如RFX1和SRF。进一步研究我们证实转录因子RFX1的表达和活性在SLE患者CD4+T细胞中显著下调。生物信息学预测CD70和CDlla基因转录起始位点上游存在RFX1结合位点,提示RFX1可能参与调控SLECD4+T细胞中CD11a和CD70等自身免疫相关基因的表达。本研究我们通过转基因和RNA干扰的方法揭示转录因子RFX1在SLE发病过程中的作用,该研究将有助于进一步阐明SLE发病的分子机制,并有可能为SLE的治疗提供新的思路和途径。第一部分筛选、鉴定具有差异活性的转录因子目的利用转录因子芯片高通量筛选在SLE患者CD4+T细胞和健康对照之间具有差异活性的转录因子。方法密度梯度离心分离6例SLE患者和6例正常人的外周血单个核细胞,磁珠分选CD4+T细胞,提取核蛋白,采用CapitalBio公司提供的含有225个转录因子探针的微阵列筛选SLE患者和正常人之间具有差异活性的转录因子。提取9例SLE患者和9例正常对照的CD4+T细胞核蛋白,利用转录因子-酶联免疫吸附试验(Transcriptional factors-enzyme linked immunosorbent assay, TFs-ELISA)检测转录因子的活性。收集31名活动期SLE患者和33名健康对照人群的外周血CD4+T细胞,采用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,实时定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)检测mRNA表达水平；抽提CD4+T细胞总蛋白,Westernblot检测蛋白表达水平。结果转录因子芯片检测结果显示：与健康对照相比,转录因子RFX1、SRF、MIF1在SLE患者CD4+ T细胞中转录活性分别下降2.55±0.18,2.85±0.28和3.03±0.4倍；而转录因子E4BP4活性升高1.58±0.25倍。进一步的TFs-ELISA实验证实：SLE患者CD4+ T细胞中RFX1和SRF转录活性显著下降,与芯片结果一致。Real-time RT-PCR及Western blot结果显示：与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞中RFX1基因mRNA、蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),SRF蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论SLE患者CD4+T细胞中多个转录因子活性发生改变,其中转录因子RFX1和SRF的活性和表达水平较健康对照均显著性降低,提示这些转录因子可能在SLE发病过程中发挥重要作用。第二部分：转录因子RFX1在SLE发病中的作用第一节特异性抑制RFX1可诱导正常CD4+T细胞自身反应性目的特异性抑制转录因子RFX1表达对正常CD4+T细胞中自身免疫相关基因CD11a和CD70的表达水平及其刺激B细胞产生自身抗体的影响。方法构建特异性抑制RFX1表达的RNA干扰载体(pSUPER.RFX1),利用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒大量抽提质粒,Lonza公司的人T细胞转染试剂盒和Amaxa nucleofector细胞转染仪用于T细胞转染。Western blot检测RFX1蛋白的表达水平,Real-time RT-PCR法检测CD11a和CD70基因mRNA的表达水平,流式细胞仪检测CD11a和CD70基因的蛋白表达水平。T细胞和同源B细胞(1：4)孵育,37℃培养8天,收集细胞培养液,ELISA法检测抗体IgG的浓度。结果与对照组相比,转染干扰载体pSUPER. RFX1的正常CD4+T细胞RFX1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(mean fluorescence intensity, MFI)水平则显著升高(P<0.01),转染干扰载体pSUPER. RFX1的正常CD4+T细胞与自身B细胞孵育,B细胞产生IgG抗体产量显著增加(P<0.05)。结论下调RFX1表达可导致CD4+T细胞自身免疫相关基因CDlla和CD70表达升高,诱导B细胞产生大量自身抗体。第二节过表达RFX1可抑制SLE患者CD4+T细胞自身反应性目的过表达转录因子RFX1对SLE患者CD4+T细胞自身免疫相关基因CD11a和CD70的表达以及其刺激B细胞产生自身抗体的影响。方法构建RFX1真核表达载体pSG5-RFX1,Lonza公司的人T细胞转染试剂盒和Amaxa nucleofector细胞转染仪用于T细胞转染。Western blot检测RFX1蛋白的表达水平,Real-time RT-PCR法检测CDlla和CD70基因mRNA水平,流式细胞仪检测CDlla和CD70蛋白水平,T、B细胞孵育实验及ELISA法检测自身抗体IgG产量。结果与对照组相比,转染pSG5-RFX1的SLE患者CD4+T细胞RFX1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),CD11a和CD70基因mRNA及蛋白(MFI)水平显著降低(P<0.01),转染pSG5-RFX1的SLE患者CD4+T细胞与自身B细胞孵育,B细胞产生IgG的产量显著降低(P<0.05)。结论增加CD4+T细胞的RFX1表达水平可抑制SLE患者CD4+T细胞自身反应性和自身抗体的产生。