一、研究背景胆道并发症仍然是严重影响肝移植受者生活质量及长期生存率的并发症之一。随着外科技术的进步,吻合口狭窄等并发症呈逐渐下降的趋势,而非吻合口并发症,如缺血型胆道病变,则成为肝移植术后胆道并发症的主要临床病理表现。肝脏移植术后缺血型胆道病变的发生机制尚不明确,目前,学者普遍认为与胆道缺血、免疫等因素有关。近年来,越来越多的研究表明胆汁中胆盐/磷脂比升高在肝移植后胆管损伤中起着重要作用。然而,肝移植后胆盐/磷脂比升高引起胆管及其上皮细胞损伤的具体机制尚无研究报道。研究表明,胆盐除了有“去污作用”外,还可在细胞内发挥信号分子的作用,参与细胞的增生和凋亡;而且由于其“去污作用”需要在高浓度下才能发挥,所以胆盐以信号分子的角色参与胆管细胞的病理生理改变可能更为普遍。在生理情况下,胆管细胞可经顶膜钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT)进行胆汁酸的重吸收,由细胞内胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein, IBABP)转运至细胞基底侧,并经有机溶质转运体α/β(organic solute transporter alpha/beta, Ostα/β)等转出至门脉系统,从而启动了胆汁酸的“胆肝循环”。平衡的“胆肝循环”不会引起胆盐在细胞内潴留,这也是胆管细胞对胆盐毒性的一种自我保护机制。研究表明在多种炎症性及代谢性疾病中,胆汁酸转运蛋白表达发生改变,引起胆汁酸转运的紊乱,从而参与了疾病的发生发展。据以上观点和现象,我们推测,在移植肝冷保存再灌注损伤时,由于炎症因子的作用及核受体(如类法尼醇受体)表达/功能的改变,胆管细胞的胆汁酸转运平衡可能受到破坏,导致胆管细胞对胆盐毒性的自我保护功能紊乱,胆盐在胆管细胞内聚集,从而引起胆管细胞的损伤。二、研究目的基于以上假设,本研究以同系大鼠肝移植模型为研究对象,探讨移植肝胆管细胞胆盐转运蛋白在胆管损伤中的作用,并利用体外培养的胆管研究类法尼醇受体(Farnesoid X receptor, FXR)对胆管细胞胆汁酸转运蛋白表达的影响,探讨肝移植后胆管细胞胆盐转运蛋白参与胆管细胞损伤的机制。三、研究方法及结果1.利用免疫组织化学检测肝组织中ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表达分布,结果显示,ASBT表达于大胆管细胞顶侧胞膜,IBABP表达于大胆管细胞浆,Ostα/Ostβ异二聚体表达于大、小胆管细胞基底侧胞膜及肝细胞血窦面胞膜。同时,我们用Real time PCR及Western blot方法检测分离的大小胆管组织中ASBT、IBABP及Ostα-Ostβ的表达,结果也显示,大胆管组织中ASBT和IBABP的表达显著高于小胆管,而Ostα-Ostβ在大胆管和小胆管组织中的表达量无显著差异。2.我们从mRNA水平和蛋白水平检测了移植肝胆管细胞胆盐转运蛋白的表达变化,并通过组织形态学观察和细胞凋亡检测评估移植肝胆管损伤的严重程度,结果显示,大鼠肝移植术后早期(术后1-3天)胆管细胞胆盐转运蛋白的表达均降低,降低幅度与供肝冷保存时间相关。随后,位于细胞顶侧的ASBT与位于胞浆内的IBABP及基底侧Ostα-Ostβ呈现不同的恢复速度及变化趋势,即ASBT很快恢复到正常水平,且在术后第7天其表达水平显著高于正常,而IBABP和Ostα-Osβ表达长时间降低,直到术后第7天(短冷却血组)甚至到第14天(长冷缺血组)才恢复到正常水平。ASBT与IBABP、Ostα和Osβ表达水平的比值与大胆管损伤严重程度显著相关。3.在检测移植肝胆汁中胆汁酸和磷脂浓度变化情况的基础上,我们通过免疫组织化学、荧光实时定量PCR、Western blotting及电泳移动漂移实验等技术,探讨不同冷保存时间下移植肝FXR表达及功能变化,结果显示,供肝冷保存再灌注损伤并不能引起胆汁中总胆汁酸的浓度的改变,只是通过降低磷脂的浓度,使胆汁酸/磷脂比增加,从而升高了胆汁中胆汁酸的相对浓度。大鼠肝移植后胆管组织中FXR的表达及功能活性显著降低,供肝冷保存时间越长,降低越明显。4.通过分离培养SD大鼠肝内胆管,探讨FXR对与胆汁共培养的胆管细胞之胆盐转运蛋白表达的影响,结果显示,在正常胆管上皮细胞中,毒性胆汁可促进ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表达均增加;而在转染了FXR shRNA的胆管细胞中,毒性胆汁可同样升高ASBT的表达,而IBABP、Ostα和Ostβ的表达并未增加,反而下降。四、结论1.胆管细胞的胆汁酸转运主要发生在大胆管细胞。2.肝移植后胆管细胞胆汁酸转运蛋白表达出现不平行的变化,这种不平行改变程度与大胆管损伤严重程度显著相关。3.肝移植后毒性胆汁促进ASBT表达快速恢复甚至高于正常水平,而由于FXR表达及功能受到抑制,阻断了胆汁酸对IBABP、Ostα和Ostβ的促进作用,使IBABP、Ostα和Ostβ表达恢复缓慢,从而引起了胆管细胞胆盐转运蛋白的不平行改变。