社会性昆虫营群居生活的特性,巢内频繁的个体接触、温暖及高湿的生境极其有利于病原菌在巣内传播。然而在漫长的自然进化过程中,在病原菌对社会性昆虫的巨大的自然选择压力下,社会性昆虫进化出了复杂的社会行为以防御病原菌在巣内传播,这种进化上的优势为利用虫生真菌防治社会昆虫提出了巨大的挑战。红火蚁(Solenopsis invicta)属于膜翅目蚁科,是一种重大入侵性社会昆虫。为了有效利用虫生真菌防治红火蚁,有必要深入研究红火蚁防御病原真菌的行为及其机制,为针对性地设计虫生真菌制剂及施用方式提供理论基础。因此,本论文针对红火蚁巣内不同分工的工蚁在病原真菌胁迫下的行为反应及其内在机制展开了研究,主要结果分述如下:1、虫生真菌菌株筛选从白僵菌(Bb02和Bb04菌株)、绿僵菌(Ma01、SM076和M09菌株)和玫烟色棒束孢(IFCF-H和IFCF-L菌株)三种被广泛用于害虫生物防治的虫生真菌中筛选对红火蚁致病力较强且无忌避性的菌株。生物测定结果表明,在侵染后第十天,Bb04、M09、Ma01和IFCF-H菌株对红火蚁的LC50分别为3.04×106、9.90×105、6.13×106和1.20×107孢子/ml,其中M09菌株的LC50最小,致病力最强,且致死时间较短,LT50为2.7天。而Bb02、SM076和IFCF-L菌株对红火蚁的致病力较弱,作用时间较长。红火蚁对菌株孢子悬浮液的觅食反应结果表明,白僵菌Bb04菌株对红火蚁具有明显的驱避作用,而其它菌株对红火蚁的驱避作用不显著。综合致病力和驱避性检测结果,绿僵菌M09对红火蚁具有较强致病能力和较快的致死效应,且M09菌株对红火蚁无明显的驱避作用,故将其作为筛选到的合适的菌株进行以下的实验。2、M09菌株的分子鉴定以及侵染红火蚁过程的电镜观察利用核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)序列对M09菌株所属亚种进行了分子鉴定。序列同源性比对及N-J进化树构建结果表明,绿僵菌M09菌株属于金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae)。扫描电镜观察表明,绿僵菌接种后,分生孢子主要附着在红火蚁的触角、脊状突起区、节间膜、刚毛窝、气孔以及褶皱处等部位,而平滑区域附着的孢子相对较少。接种后12小时,大部分分生孢子萌发形成芽管,少数分生孢子可形成双芽管。接种24小时后,部分芽管末端膨大形成附着胞,芽管或附着胞在体壁上分泌少量分泌物。最后芽管伸长穿透红火蚁体壁,进入表皮层及体腔。透射电镜观察表明,接种24小时后,侵入红火蚁表皮的芽管生长并产生颗粒状菌丝和长丝状菌丝段,寄主的表皮在菌丝侵染的机械力的作用下开始呈波浪起伏状。接种36小时后,表皮层中的菌丝开始侵入肌肉组织,伴随着机械压力以及分泌活性物质,菌丝段旁边的肌肉组织出现溶解。接种72小时后,菌丝开始侵入中肠细胞,破坏中肠的消化功能。接种96小时后,绿僵菌菌丝通过分隔的方式在红火蚁体内大量繁殖,红火蚁的器官和组织慢慢溶解。3、绿僵菌胁迫对育幼蚁护蛹行为的影响在社会性昆虫中,幼虫作为最宝贵的下一代资源,对其种群的发展和壮大具有举足轻重的作用。研究结果表明,当蛹被绿僵菌侵染后,工蚁对蛹的育幼行为显著增加,主要表现为:工蚁对侵染蛹的育幼总时间为对照组的5.3倍,每次照顾幼虫的平均持续时间为对照组的5.2倍。而且,育幼行为能显著减少侵染蛹的体表分生孢子数量,在无工蚁、2只工蚁和10只工蚁存在条件下,蛹体表平均孢子数分别为103.1、51.6和31.3个。此外,工蚁的育幼还能抑制蛹体表孢子的萌发,处理20小时后,无工蚁、2只工蚁和10只工蚁存在条件下,蛹体表孢子萌发率分别为95.1%、80.4%和59.9%。蛹的羽化率也随着工蚁数量增加显著升高。红火蚁工蚁通过育幼行为防御病原真菌侵染蛹的策略为种群的延续和发展提供了保障。4、绿僵菌胁迫对育幼蚁向觅食蚁行为转变的影响及转录组分析红火蚁具有根据年龄调节工蚁劳动分工行为的能力,即年纪较小的工蚁在巢内从事哺育幼蚁和照顾蚁后的任务,随着年龄的增大(2-3周),工蚁转变成为出巢从事觅食和防御等任务的觅食蚁。病原真菌侵染对这种行为转变有一定的影响,具体表现为育幼蚁被绿僵菌侵染后,在蛹室的活动时间逐渐减少,由第1天的103.4秒降低至第3天的38.5秒;而且育幼时间占蛹室活动时间的比例也降低,由第1天的13.6%降低至第3天的3.5%;幼蚁感病三天后接触蚁后的次数也显著减少。说明育幼蚁在绿僵菌侵染胁迫下会加速从巢内向巢外活动,且行为方式由育幼蚁转换成觅食蚁。健康育幼蚁、感病育幼蚁和觅食蚁所共有的基因聚类分析表明,虽然育幼蚁感病后其行为会提前向觅食蚁转变,但整体的基因表达模式并未向觅食蚁转变。育幼蚁被真菌感染后,有289个基因表达水平发生显著变化,其中190个基因显著上调。go注释显示差异表达基因显著富集于17条goterm。而育幼蚁-觅食蚁间共有284个显著差异表达基因,共富集到16条goterm上。通过比较健康-感病育幼蚁和育幼蚁-觅食蚁的rna-seq,发现共有43个差异表达基因,包括一些解毒酶基因p450及气味结合蛋白gp-9;且有11条通路在两组中均显著富集,包括抗氧化活性和离子结合功能基因的富集。两组间共同差异表达的这43个基因和11个go通路可能调控育幼蚁感病后的行为,使其向觅食蚁行为转变。5、绿僵菌胁迫影响觅食蚁的觅食和交哺行为红火蚁被真菌侵染后第4天取食量明显比对照增多,为0.78μg/只,而对照为0.62μg/只,表明真菌侵染红火蚁后耗费了红火蚁的能量物质,所以红火蚁需要取食更多以维持体内能量平衡。食物中添加苦味性生物碱(奎宁)对红火蚁具有明显的驱避作用,然而当红火蚁被真菌侵染后第3天开始,红火蚁对含奎宁的食物耐受性增强,忍耐值(ti)第1、2天分别为-0.12和0.01,而第3天高达0.35。虽然被真菌侵染后,红火蚁的觅食量增加,但是体内的觅食基因的表达和对照没有显著差异(p>0.05)。故红火蚁的觅食行为变化和觅食基因没有关联。此外,被真菌侵染后第3天,红火蚁的交哺行为频率也比对照显著增加,染菌蚂蚁为3.1次/分钟,而对照为1.4次/分钟。但是体表的16种表皮碳氢化合物的含量没有明显变化,推测感病工蚁不是通过体表的碳氢化合物变化来告知同伴自己的感病状况。6、绿僵菌胁迫下红火蚁梳理行为变化红火蚁的梳理行为对抵御真菌的侵染效果具有重要作用。在不同工蚁密度下,红火蚁对绿僵菌的抵抗力不同,单头工蚁时被绿僵菌侵染后的死亡风险比率是群体时的1.8倍。单头红火蚁情况下被真菌处理的蚂蚁表现出更多的自我梳理行为,梳理行为的总时间和每次持续时间分别为47.2和15.1秒,而对照分别为6.5和2.4秒。群体条件下,同伴对被绿僵菌侵染的蚂蚁表现更多的相互梳理行为,对真菌侵染蚂蚁的相互梳理行为的总时间和每次持续的时间分别为39.2和14.84秒,而对对照蚂蚁分别为21.6和5.5秒。群体条件下蚂蚁体表更多的孢子被移除,单头蚂蚁情况下自我梳理行为仅能移除体表21.9%的孢子,而群体条件下能移除体表77.3%的孢子,说明相互梳理行为比自我梳理行为的清洁作用更强。红火蚁同伴之间的梳理行为增加了健康同伴接触病原真菌的机会,可能导致同伴也被真菌感染,之前未接触感病同伴的红火蚁,死亡风险比率是之前接触感病同伴蚂蚁的1.52倍。说明接触到少量的病原真菌的同伴不仅不会导致死亡率明显上升,反而在短期内能够有效提高其对病原真菌的免疫能力,间接证明红火蚁中存在社会免疫现象。7、绿僵菌胁迫加快红火蚁的搬尸行为同巢和异巢蚂蚁的尸体诱导红火蚁的搬尸行为的时间不同,同巢同伴尸体平均需要495秒才能诱导红火蚁的搬尸行为,而异巢蚂蚁尸体只需305秒;红火蚁蚂蚁对异巣死亡1小时内的蚂蚁尸体的攻击反应更强。红火蚁对同巢中不同发育阶段(成虫和蛹)的同伴尸体表现的搬尸行为不同,红火蚁在1小时内就将几乎所有的工蚁尸体丢至弃尸堆,而对蛹尸体,则需24-48小时才能识别尸体并将其丢至弃尸堆。红火蚁死亡1小时内即能诱发同伴的搬尸行为,说明同伴能够快速识别成虫的尸体;但是未检测到成虫死亡1小时后体表化学物质变化。蛹死亡24小时后,被绿僵菌侵染的蛹尸体体表脂肪酸含量明显高于对照,染菌尸体体表棕榈酸、亚油酸和油酸含量分别为0.62、0.7和1.1μg/只,而对照分别为0.38、0.27和0.42μg/只。将三种脂肪酸纯品滴加在刚死亡的蛹体表时,能显著增加蛹尸体被丢至弃尸堆的比例,滴加棕榈酸、亚油酸和油酸的蛹尸体被搬运到弃尸堆的比例分别为11.1%、50.5%和68.9%。说明三种脂肪酸均能诱发红火蚁对蛹的搬尸行为,其中油酸诱发红火蚁搬尸行为的效果最强。被绿僵菌侵染的蛹尸体体表脂肪酸的快速积累诱导红火蚁的搬尸行为有利于降低其它蛹、幼蚁或蚁后被真菌侵染的风险,降低真菌在蚁巢内流行的可能性。结论:在病原真菌胁迫下,不同品级的红火蚁工蚁会通过社会行为以抑制病原真菌在蚁巣内传播。当幼虫被真菌感染后,育幼蚁会表现更频繁的育幼行为以减少孢子的附着及萌发,增加幼虫的存活的机会;而当育幼蚁自身被感染真菌后则会减少和巣内的幼虫及蚁后接触,避免将真菌传染给巣内重要的个体。觅食蚁被感染后,会增加觅食和交哺行为;并改变其对食物的偏好性,对原来拒绝取食的奎宁类生物碱变为主动取食,从而增强了其对真菌侵染的抵抗能力。工蚁被真菌感染后,清洁蚁会对被感染真菌的蚂蚁表现更多的梳理行为,减少真菌孢子在其体表的附着量。而且和被真菌感染的同伴接触后工蚁自身的免疫力会显著升高。被真菌感染的蛹尸体表面会快速积累棕榈酸、亚油酸和油酸,用以诱导清洁蚁将其尸体快速搬至弃尸堆。在病原真菌胁迫下,红火蚁不同品级的工蚁表现出的这些社会防御行为有效地抑制了病原菌在蚁巣内传播,对利用虫生真菌防治红火蚁提出了极大的挑战。