【摘 要】
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目的:通过无镁细胞外液孵育,建立离体原代海马神经元癫痫样放电模型,来检测钙敏感受体和Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡蛋白的变化情况,研究维生素D对癫痫样放电细胞中Ca SR及相关凋亡蛋白的的影响,为癫痫的药物治疗提供新靶点与新思路。方法:取1～3日龄内出生乳鼠海马组织,采用Neurobasal+B27改良无血清法培养海马神经元细胞,将培养至第12日的细胞全液更换为无镁细胞外液孵育3小时
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目的:通过无镁细胞外液孵育,建立离体原代海马神经元癫痫样放电模型,来检测钙敏感受体和Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡蛋白的变化情况,研究维生素D对癫痫样放电细胞中Ca SR及相关凋亡蛋白的的影响,为癫痫的药物治疗提供新靶点与新思路。方法:取1～3日龄内出生乳鼠海马组织,采用Neurobasal+B27改良无血清法培养海马神经元细胞,将培养至第12日的细胞全液更换为无镁细胞外液孵育3小时,随机分为6个组,分别为:正常组、无镁细胞外液诱导组、无镁细胞外液诱导+丙戊酸钠组、无镁细胞外液诱导+维生素D组、无镁细胞外液诱导+维生素D+NPS2390组、无镁细胞外液诱导+维生素D+精胺组。通过HE染色、TUNEL染色和MTT比色法,观察各组海马神经元细胞形态变化及细胞存活率,western blot检测各组Ca SR、Bax、Bcl-2和Caspase-3等蛋白的表达情况。结果:经HE染色结果显示正常组细胞完整,胞体圆润且着色浅;无镁使细胞核固缩,损伤严重;丙戊酸钠组、维生素D和NPS2390组突触连接相对完整,细胞损伤程度减轻;激动剂精胺使细胞突触变短,数量变少,体积变小,损伤进一步加重。MTT结果显示,无镁干预使细胞存活率显著降低（P＜0.01）;丙戊酸钠使细胞存活率显著增高（P＜0.01）;维生素D组使细胞存活率明显增高（P＜0.05）;与无镁外液+丙戊酸钠组相比,无镁外液+维生素D细胞存活率减少,无统计学差异（P＞0.05）;加入NPS2390可以使细胞存活率增加,无统计学差异（P＞0.05）;加入精胺可以明显降低细胞存活率（P＜0.05）。TUNEL结果显示,无镁外液孵育使细胞凋亡率增加（P＜0.01）;丙戊酸钠组和维生素D组使细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）;与无镁外液+丙戊酸钠组相比,无镁外液+维生素D凋亡率增加,无统计学差异（P＞0.05）,加入NPS2390可以使细胞凋亡率明显减少（P＜0.05）;加入精胺细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹结果显示,无镁细胞外液使Ca SR、Bax蛋白表达显著增加（P＜0.01）,Caspase-3蛋白表达增加（P＞0.05）,Bcl-2蛋白表达显著降低（P＜0.01）;经过维生素D干预后,Ca SR蛋白表达显著降低（P＜0.01）,Bax蛋白表达明显减少（P＜0.05）,Caspase-3蛋白表达减少,无统计学差异（P＞0.05）,而Bcl-2蛋白表达明显增高（P＜0.05）;在维生素D干预前,分别使用NPS2390和精胺预处理,Ca SR蛋白表达分别降低,无统计学差异（P＞0.05）和明显增加（P＜0.05）;Bax蛋白表达分别降低,无统计学差异（P＞0.05）和明显增加（P＜0.05）;Caspase-3蛋白表达降低,无统计学差异（P＞0.05）和增加,无统计学差异（P＞0.05）;Bcl-2蛋白表达分别增加,无统计学差异（P＞0.05）和明显降低（P＜0.05）。结论:1.无镁细胞外液能诱导海马神经元损伤;2.维生素D干预后,癫痫样放电海马神经元细胞Ca SR、Bax表达减少,Bcl-2的表达增加;3.维生素D干预能使细胞存活率增加,并能抑制海马神经元的凋亡,保护了神经细胞,具有抗癫痫作用。
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