【摘 要】
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目的本研究旨在细胞及动物水平探讨白藜芦醇对乳腺癌的抑制作用,并通过PGK1糖酵解途径阐明其抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的相关分子机制,为乳腺癌的预防和治疗提供理论基础和实验论据。方法MTT法检测不同浓度的白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞增殖的影响;细胞划痕及Transwell小室检测白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞迁移及侵袭能力的影响;流式细胞术检测白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞凋亡的影响
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目《代谢酶PGK1表观遗传修饰在乳腺癌中的作用及机制》（81972491）；
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目的本研究旨在细胞及动物水平探讨白藜芦醇对乳腺癌的抑制作用,并通过PGK1糖酵解途径阐明其抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的相关分子机制,为乳腺癌的预防和治疗提供理论基础和实验论据。方法MTT法检测不同浓度的白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞增殖的影响;细胞划痕及Transwell小室检测白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞迁移及侵袭能力的影响;流式细胞术检测白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞凋亡的影响;比色法及酶标法检测白藜芦醇对乳腺癌BT-549细胞糖酵解相关酶活性及ATP含量的影响;生物信息学分析PGK1在乳腺癌中的临床意义;分子对接预测白藜芦醇与PGK1对接活性;RT-q PCR和Western blot检测白藜芦醇对PGK1及其上游转录因子c-myc和PPARγ表达的影响;Western blot检测白藜芦醇对侵袭转移及凋亡相关蛋白的影响;小鼠成瘤实验检测白藜芦醇体内抑瘤作用,HE染色观察白藜芦醇对肿瘤组织形态学特征的变化,IHC检测白藜芦醇对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤PGK1、PCNA、MMP9及Caspase-3蛋白表达的变化。结果1.白藜芦醇（0、2、4、8、16、32、64和128μg/mL）作用于乳腺癌细胞24h和48h,结果显示白藜芦醇可显著抑制乳腺癌BT-549细胞增殖,并呈时间及剂量依赖性。其24h的IC50=40.47μg/mL,48h的IC50=25.55μg/mL;2.白藜芦醇呈剂量依赖性诱导乳腺癌BT-549细胞凋亡,抑制细胞迁移及侵袭能力,同时明显降低糖酵解反应中HK、PK、PGK1、LDH酶活性及ATP含量;3.GEPIA数据库预测PGK1基因在三阴性基底样型、HER2和Luminal-B型乳腺癌中呈高表达,并且PGK1高表达患者总生存率较低,预后较差,分子对接技术预测白藜芦醇与PGK1具有结合相关性,其对接结合能均≤-5k J·mol-1,对接活性良好;4.白藜芦醇可明显降低PGK1下游PKM2、SIRT5蛋白表达及PI3K/GSK-3β/β-catenin信号通路;降低增殖、迁移侵袭关键蛋白PCNA、MMP2及MMP9的表达水平;下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达,上调促凋亡蛋白BAX、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-7蛋白表达;5.白藜芦醇可上调PPARγ的表达、下调c-myc的表达,同时抑制PGK1 m RNA及蛋白表达。c-myc抑制剂10058-F4显著抑制BT-549细胞c-myc及PGK1蛋白表达,并且与白藜芦醇具有正协同作用;PPARγ激活剂WY-14643可增加BT-549细胞PPARγ蛋白表达,并明显抑制PGK1蛋白表达,与白藜芦醇也具有正协同作用。6.小鼠乳腺癌移植瘤造模后,与模型组相比,各组小鼠体重无明显差异,但白藜芦醇治疗组荷瘤小鼠的瘤重及瘤体积明显减小;7.与模型组比较,白藜芦醇（20、50、100mg/kg）呈剂量依赖性降低乳腺癌荷瘤鼠肿瘤PGK1、PCNA及MMP9蛋白的阳性表达率,增加Caspase-3蛋白的阳性表达率,且白藜芦醇（100mg/kg）组与环磷酰胺阳性对照组无明显差异。结论1.白藜芦醇体外能够抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭迁移、诱导细胞凋亡,体内可抑制小鼠乳腺癌移植瘤生长,在体内外均发挥抑癌作用。2.白藜芦醇通过调控转录因子c-myc和PPARγ而降低乳腺癌BT-549细胞中PGK1的表达,导致细胞糖酵解途径受阻,进而抑制乳腺癌细胞恶性生物学行为。
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