背景:　　中枢神经系统(central nervous system，CNS)炎症常见于脑血管疾病、感染、自身免疫性脱髓鞘疾病以及其它一些神经内科疾病。调查表明:我国细菌性脑膜炎的年发病率约为3/10万，病毒性脑膜炎则更为常见，发病率为11-27/10万。中枢神经系统炎症病程长，致死率高，患者预后不佳，随着我国人口老龄化的进一步加快，其必将成为我国卫生健康系统主要负担和支出方向。　　免疫细胞招募在中枢神经系统炎症中至关重要。中枢神经系统属于免疫豁免器官，被血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）所保护。但是在脑部感染、创伤和自身免疫性疾病等情况下，免疫细胞能够穿越血脑屏障进入CNS皮质。大多数CNS炎症性疾病中普遍存在免疫细胞的浸润，阻断炎症中免疫细胞进入中枢神经系统，多数情况下对炎症和神经症状有较好的改善作用。　　近年来，新型的免疫抑制药物FTY720得到越来越多的关注。FTY720（GILENYATM，Novartis Pharma AG，Basel，Switzerland）又被称为盐酸芬戈莫德(fingolimod)，由日本的Yoshitomi制药公司于1992年首次合成。它是由冬虫夏草中提取的多球壳菌素(myriocin，ISP-1)经化学修饰后人工合成的药物。FTY720可被鞘氨醇激酶(sphingosine kinase)迅速磷酸化成具有生物活性的FTY720-P。机体内共有两种鞘氨醇激酶——Ⅰ型鞘氨醇激酶（SphK1）和Ⅱ型鞘氨醇激酶2(SphK2)，其中Sphk2是体内介导FTY720磷酸化的主要激酶。FTY720与FTY720-P分别是鞘氨醇与1-磷酸鞘氨醇的结构类似物。因此，FTY720-P可通过与S1P竞争性结合S1P的内源受体，发挥生物学效应。机体内目前存在S1P1，S1P1，S1P3，S1P4以及S1P55种S1P受体，而FTY720可以与其中的S1P1，S1P3，S1P4以及S1P5高亲和力结合。　　FTY720是第一种应用于治疗复发型多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)的口服制剂。与目前用来治疗MS的其他免疫调节剂不同，FTY720可以凭借其脂溶性结构轻易地进入中枢神经系统，而中枢神经系统中目前已知的所有类型细胞在生理和病理条件下细胞表面均可表达S1P受体。两者共同提示FTY720有可能在中枢神经系统中具有重要调控作用。FTY720对MS以及其动物模型——实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用已得到广泛报道。此外，有研究发现FTY720可以减轻大鼠视神经炎模型中的轴突损伤，脱髓鞘症状以及炎症水平;通过上调小鼠脑中BDNF表达水平，FTY720可以改善小鼠Rett综合症的神经缺损症状;FTY720还可以减少脑缺血再灌注动物模型中脑损伤面积并改善预后。而FTY720对中枢神经系统炎症状态下免疫细胞的招募及其具体机制目前尚不清楚。　　目的:　　了解FTY720对中枢神经系统炎症中免疫细胞招募的影响及其调控机制，为实现对中枢神经系统炎症的干预提供理论基础和新的线索。　　方法:　　1.总体设计:　　本研究首先建立了小鼠中枢神经系统炎症模型，并观察FTY720对中枢神经系统炎症中免疫细胞招募的影响;其次，分别通过检测脑中趋化因子，炎性细胞因子，粘附分子以及白蛋白的表达，明确FTY720对炎症状态下脑中胶质细胞，内皮细胞以及血脑屏障通透性的影响，确定FTY720通过抑制内皮细胞激活来影响细胞招募，并通过体外实验进行验证;通过分别阻断鞘氨醇激酶和S1P1受体，确定FTY720作用于内皮细胞所依赖的激酶与受体类型;使用信号通路磷酸化广谱筛选芯片探索FTY720对内皮细胞内信号通路磷酸化水平的影响;最后，使用磷酸酶PP2A与PTEN的抑制剂，确定PP2A参与FTY720对内皮细胞激活的抑制，并检测FTY720对内皮细胞内PP2A表达的影响。　　2.FTY720对中枢神经系统炎症中免疫细胞招募的影响　　通过侧脑室注射LPS构建小鼠中枢神经系统炎症模型并将小鼠平均分为两组，腹腔注射FTY720治疗组，腹腔注射生理盐水对照组。　　2.1.FTY720对中枢神经系统炎症中中性粒细胞浸润的影响　　LPS处理24h后处死小鼠，取脑组织进行石蜡切片以及酯酶染色，记录并比较两组小鼠脑皮质与海马区内中性粒细胞浸润的数量。　　2.2.FTY720对中枢神经系统炎症中白细胞招募的影响　　LPS处理4h后麻醉小鼠，通过活体显微镜技术记录并比较两组小鼠脑微血管表面粘附与滚动的白细胞的数量。　　3.FTY720对中枢神经系统炎症中胶质细胞，内皮细胞与血脑屏障通透性的影响　　通过侧脑室注射LPS构建小鼠中枢神经系统炎症模型并将小鼠平均分为两组，腹腔注射FTY720治疗组，腹腔注射生理盐水对照组。LPS处理4h或24h后，处死小鼠，取出脑组织，提取RNA及蛋白质。　　3.1.FTY720对中枢神经系统炎症中胶质细胞激活的影响　　使用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测并比较两组小鼠脑中趋化因子KC，MIP-2以及炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达。　　3.2.FTY720对中枢神经系统炎症中内皮细胞激活的影响　　3.2.1.使用Real Time-PCR及Western blotting方法检测并比较两组小鼠脑中细胞粘附分子P-selectin、E-selectin以及VCAM-1的表达。　　3.2.2.使用LPS与FTY720分别单独处理或共同处理小鼠脑微血管内皮细胞株bEND.3，收取细胞蛋白，检测粘附分子P-selectin、E-selectin以及VCAM-1的表达，进一步验证体内实验结果。　　3.3.FTY720对中枢神经系统炎症中血脑屏障通透性的影响　　使用Western blotting方法分别检测LPS与FTY720分别单独处理或共处理小鼠4h和24h后小鼠脑中白蛋白的蛋白表达水平。　　4.探索FTY720对中枢神经系统炎症中免疫细胞招募的调控机制　　预先分别阻断不同类型鞘氨醇激酶或鞘氨醇受体，通过体内和体外实验观察并比较阻断不同鞘氨醇激酶或受体后FTY720对中枢神经系统炎症状态下免疫细胞招募与内皮细胞激活的影响。　　5.FTY720影响中枢神经系统炎症中内皮细胞激活的通路研究　　使用LPS与FTY720分别单独处理或共同处理小鼠脑微血管内皮细胞株bEND.3，使用CSP100信号通路磷酸化广谱筛选芯片探索FTY720对内皮细胞内多条信号通路磷酸化水平的影响，并使用Western blotting在体外检测信号分子Akt，Ⅰ-κBα与转录因子NF-κ B，STAT6的磷酸化水平，进行验证。　　6.FTY720对内皮细胞内磷酸酶PP2A表达的影响　　预先使用特异性抑制剂分别阻断磷酸酶PP2A与PTEN，使用LPS与FTY720分别单独处理或共同处理小鼠脑微血管内皮细胞株bEND.3，检测粘附分子P-selectin，VCAM-1以及转录因子NF-κB的表达水平。通过Westernblotting检测FTY720及PP2A抑制剂对内皮细胞内磷酸酶PP2A表达水平的影响。　　结果:　　FTY720可以显著抑制小鼠中枢神经系统炎症状态下脑皮质和海马区内中性粒细胞浸润以及白细胞在脑微血管表面的粘附与滚动。FTY720并未影响LPS引起的小鼠脑组织中趋化因子KC、MIP-2和炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达，却显著抑制了小鼠脑中以及体外培养的内皮细胞表面粘附分子P-selectin、E-selectin以及VCAM-1的表达。这一抑制效应依赖于Ⅱ型鞘氨醇激酶与Ⅰ型鞘氨醇受体。此外，FTY720降低了LPS侧脑室注射24h后血脑屏障的通透性。FTY720可以显著抑制内皮细胞内包括NF-κB在内的多个信号分子的磷酸化。FTY720可以通过促进磷酸酶PP2A的表达，抑制NF-κB的磷酸化，从而抑制粘附分子P-selectin与VCAM-1的表达。　　结论:　　在中枢神经系统炎症状态下，FTY720被Ⅱ型鞘氨醇激酶磷酸化为FTY720-P，通过结合内皮细胞表面的S1P1，激活受体下游信号通路，并促进磷酸酶PP2A的表达，下调LPS引起的内皮细胞内包括信号分子Akt，Ⅰ-κBα以及转录因子NF-κB及STAT6在内的多个信号分子的磷酸化、继而抑制内皮细胞粘附分子P-selectin，E-selectin以及VCAM-1的表达，最终抑制白细胞在脑微血管内皮表面的招募级联。