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第一部分建立2型糖尿病大鼠模型并评价十二指肠空肠旁路术对2型糖尿病大鼠糖代谢的影响背景随着社会经济的不断发展和人们生活方式的改变,糖尿病已成为世界范围内严重危害人类健康的慢性疾病之一,其中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)所占的比例高达90%,而且糖尿病患者的数量在不断增长。据国际糖尿病联盟公布的数据,2014年全球糖尿病患者总数达3.87亿,到2035年,预计可达5.92亿。传统治疗2型糖尿病的方法主要包括控制饮食、加强运动、口服降糖药和使用胰岛素等,这些方法虽然能在短期内控制血糖,但因其需要长期治疗甚至终生维持,患者依从性差,其控制血糖的远期效果并不理想。所以,寻找新的、治疗效果好且持久的糖尿病治疗方法已成为全球关注的热点。上世纪60年代,临床研究发现合并2型糖尿病的肥胖症患者在接受减肥手术后,在体重显著减轻之前其血糖快速恢复了正常,而且不再需要降糖药物来维持,从而找到了通过外科手术来治疗糖尿病的新途径。目前,Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass,RYGB)作为标准减肥术式之一,可使肥胖症患者伴随的2型糖尿病得到明显改善甚至完全缓解,但患者术后体重会明显减轻,不建议将其用于治疗非肥胖型2型糖尿病患者。而我国2型糖尿病患者又以非肥胖型多见,如果能找到针对非肥胖2型糖尿病患者的手术方法,这将给广大非肥胖糖尿病患者带来福音。经过不断探索和实践,一种旷置十二指肠和近端空肠,而保留胃容积的新的手术方式—十二指肠空肠旁路术(duodenal-jejunal bypass,DJB)应运而生。十二指肠空肠旁路术对非肥胖2型糖尿病的治疗效果已得到广泛认可,但是其机制不明确,需要更为深入地研究。基于以上原因,建立糖尿病动物模型并对其实施十二指肠空肠旁路术,已成为进一步深入研究其机制的必要条件和基础。目的本部分研究选择以高脂饮食及小剂量链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型为研究对象,首先对建立的糖尿病大鼠模型进行评估,然后实施十二指肠空肠旁路术,评价十二指肠空肠旁路术对糖代谢指标的影响。方法本部分研究通过高脂饲料喂养的方法诱导雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠产生胰岛素抵抗,腹腔内注射小剂量STZ(35mg/kg)诱导大鼠出现高血糖状态。通过测定其空腹血糖、随机血糖及胰岛素抵抗实验(insulin tolerance test, ITT)对建立的糖尿病大鼠模型进行评估。对建模成功的大鼠分别实施十二指肠空肠旁路术(duodenal-jejunal bypass,DJB)及假手术(SHAM),以正常SD大鼠作为空白对照(CON),在特定的时间点对以下指标进行检测或计算：(1)各组大鼠的体重和能量的摄入量；(2)空腹血糖：检测各组大鼠的空腹血糖；(3)随机血糖：检测各组大鼠的随机血糖；(4)口服葡糖糖耐量实验(oral glucose tolerance test, OGTT):分别在手术前及术后第2、4、8、12、16周进行检测；(5)胰岛素耐量实验(insulin tolerance test, ITT):分别在手术前及术后第2、4、8、12、16周进行检测；(6)计算胰岛素抵抗指数(Homeostasis model of assessment for insulin resistance index,HOMA-IR),采用计算公式HOMA-IR=空腹胰岛素(mIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5,分别于术前、术后2周、术后16周测定相应数据并计算胰岛素抵抗指数。以胰岛素耐量实验(ITT)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)实验结果来初步评估十二指肠空肠旁路术对2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性的影响；(7)葡萄糖刺激的胰岛素分泌：分别于术后第2、16周检测血清胰岛素水平。结果1.高脂饲料喂养及腹腔注射小剂量链脲佐菌素成功诱导出糖尿病大鼠模型,此模型具备胰岛素抵抗(表现为AUCITT升高)及高血糖(开始时主要表现为随机血糖升高明显,其空腹血糖逐渐升高)的特点。2.十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)与假手术组(SHAM组)两组大鼠的在体重和摄入能量方面,术前及术后差异无统计学意义(P>0.05)。3.术前,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠的空腹血糖与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义,在术后第2、4、6、8、10、12、14、16周,DJB组大鼠的空腹血糖较SHAM组降低,P<0.05,其差异有统计学意义,表明十二指肠空肠旁路术能够明显改善2型糖尿病大鼠的空腹血糖。4.术前,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠的随机腹血糖与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义,在术后第1、2、4、6、8、10、12、14、16周,DJB组大鼠的随机血糖较SHAM组降低,P<0.05,其差异有统计学意义,表明十二指肠空肠旁路术能够明显改善2型糖尿病大鼠的随机血糖。5.术前,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠的AUCOGTT值与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义,在术后第2、4、8、12、16周,DJB组大鼠的AUCOGTT值低于SHAM组,P<0.05,差异有统计学意义,表明十二指肠空肠旁路术能够明显改善2型糖尿病大鼠的糖耐量。6.术前,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠的AUCITT值与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义,在术后第2、4、8、12、16周,DJB组大鼠的AUCITT值低于SHAM组,P<0.05,差异有统计学意义,表明十二指肠空肠旁路术能够明显改善2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。7.术前,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠的胰岛素抵抗指数与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义。在术后第2周和第16周,DJB组大鼠的胰岛素抵抗指数较SHAM组降低,P<0.05,差异有统计学意义,表明十二指肠空肠旁路术能够显著缓解2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。8.在术后第2周和第16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠葡萄糖刺激的血清胰岛素浓度与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义。结论1.成功建立了SD大鼠的糖尿病动物模型并成功实施了十二指肠空肠旁路术及假手术,并证实了十二指肠空肠旁路术可以显著地改善2型糖尿病大鼠的糖代谢(空腹血糖、随机血糖及糖耐量),且这种改善作用不依赖于术后体重的下降及进食量的减少。2.十二指肠空肠旁路术可以明显改善2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性,显著缓解胰岛素抵抗,但是在术后短期内并不会明显增加胰岛素的分泌。第二部分十二指肠空肠旁路术对2型糖尿病大鼠肝脏内质网应激状态及相关信号通路的影响背景胰岛素抵抗是2型糖尿病的一个重要特征,是指胰岛素敏感靶器官对葡萄糖摄取、利用受损和肝脏葡萄糖输出增多。虽然胰岛素抵抗具有明显的特征性,但胰岛素抵抗发生的机制仍不明确。近年来大量证据表明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在导致胰岛素抵抗过程中具有重要的作用。内质网是一个重要的细胞器,用于协调蛋白质的合成,折叠和运输。附着于内质网膜上的核糖体释放新合成的肽进入内质网腔,其中的蛋白质分子伴侣和折叠蛋白协助这些肽进行正确翻译后修饰和折叠。正确折叠的蛋白质,被释放到高尔基复合体进行最终修饰,然后最终将它们送至最终目的地。如果蛋白质合成过多或错误折叠的肽的流入超过内质网的处理能力时,内质网腔内积累了大量未处理的蛋白质,进而引发了内质网应激。内质网膜上有3个跨膜信号分子：肌醇需求激酶-1 (inositol-requiring enzyme-1,IRE-1)、双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网蛋白激酶(PKR-like ER protein kinase,PERK)和活化转录因子-6 (activating transcription factor-6,ATF-6)。当内质网应激发生时,这些跨膜信号分子游离并进入细胞质,触发未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR),以恢复内质网的功能。以往的研究表明,内质网应激通过肌醇需求激酶-1(IRE-1)触发c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)通路的活性,JNK激活可使胰岛素受体底物-1 (insulin receptor substrate-1,IRS-1)丝氨酸307位点(Ser307)发生磷酸化,胰岛素受体底物正常的酪氨酸磷酸化则受到抑制。一般情况下,胰岛素与其受体的结合会引起胰岛素受体构型的变化,这种构型的变化引起胰岛素受体胞质域特定酪氨酸残基的磷酸化,进而引起胰岛素受体底物的聚集。酪氨酸磷酸化是胰岛素受体底物激活和胰岛素敏感性所必须的,这种作用可被胰岛素受体底物丝氨酸磷酸化所阻滞,导致胰岛素与胰岛素受体结合下降,最终致胰岛素抵抗和糖尿病的发生。十二指肠空肠旁路术对内质网应激状态及相关信号通路的影响,目前还未见报道。目的本部分研究旨在探讨十二指肠空肠旁路术对2型糖尿病大鼠肝脏组织内质网应激状态及与之相关的信号转导通路的影响,以期进一步阐明十二指肠空肠旁路术改善2型糖尿病大鼠糖代谢的内在机制。方法各组存活的全部大鼠(DJB组14只、SHAM组13只、空白对照组10只)于术后16周处死,取各组大鼠肝脏组织应用蛋白印记(Western blotting)技术对以下指标进行检测：(1)肝脏内质网应激指标p-PERK、IRE-1、p-IRE-1的表达变化；(2)肝脏组织中总JNK蛋白、p-JNK蛋白的表达变化；(3)肝脏组织中IRS-1蛋白及p-IRS-1Ser307蛋白的表达变化。结果1.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)与假手术组(SHAM组)两组大鼠的肝脏组织均表达了磷酸化PERK蛋白(p-PERK); DJB组大鼠肝脏组织中磷酸化PERK蛋白(p-PERK)的相对表达量较SHAM组下降,P<0.05,差异有统计学意义。2.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠肝脏组织中IRE-1蛋白的相对表达量与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义；但DJB组大鼠肝脏组织中磷酸化IRE-1蛋白(p-IRE-1)的相对表达量(即p-IRE-1/IRE-1的比值)较SHAM组下降,P<0.05,差异有统计学意义。3.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠肝脏组织中总JNK蛋白的相对表达量与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义；但DJB组大鼠肝脏组织中磷酸化JNK蛋白(p-JNK)的相对表达量(即p-JNK/total JNK的比值)较SHAM组下降,P<0.05,差异有统计学意义。4.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)大鼠肝脏组织中IRS-1蛋白的相对表达量与假手术组(SHAM组)相比,P>0.05,差异无统计学意义；但DJB组大鼠肝脏组织中丝氨酸307位点磷酸化的IRS-1蛋白(p-IRS-1Ser307)相对表达量(即p-IRS-1Ser307/IRS-1的比值)较SHAM组下降,P<0.05,差异有统计学意义。结论1.十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)与假手术组(SHAM组)两组大鼠术后肝脏组织中均表达了内质网应激的标志性蛋白p-PERK,表明两组大鼠均发生了内质网应激。2.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)较假手术组(SHAM组)大鼠肝脏组织中PERK蛋白及IRE-1蛋白的磷酸化水平明显下降,表明十二指肠空肠旁路术能够显著减少2型糖尿病大鼠肝脏组织的内质网应激,缓解2型糖尿病大鼠的内质网应激状态。3.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)较假手术组(SHAM组)大鼠肝脏组织中JNK的磷酸化水平明显下降,表明十二指肠空肠旁路术能够显著降低2型糖尿病大鼠JNK通路的活性。4.术后16周,十二指肠空肠旁路手术组(DJB组)较假手术组(SHAM组)大鼠肝脏组织中IRS-1丝氨酸307位点磷酸化水平明显下降,继而使其胰岛素信号通路得到了明显改善。