壳聚糖（chitosan）是由甲壳素（chitin）经过脱乙酰作用得到的具有独特功能特性的天然阳离子聚合物,由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成。研究表明壳聚糖在生活中每个领域都有广泛的应用,但由于壳聚糖分子量较大,不易溶于水,只能溶解在某些酸性溶液中,严重阻碍了壳聚糖的应用价值。壳聚糖酶水解壳聚糖产生低分子量的壳寡糖具有十分广泛的应用,构建具有高酶活的壳聚糖酶对扩大壳聚糖在工业、医药及化妆品等领域应用具有十分重要的作用。本实验初步探究了Bacillus nakamurai壳聚糖酶的酶学性质及活性结合位点,主要内容及结果如下:1.根据NCBI网站GeneBank数据库所提供的Bacillus nakamurai壳聚糖酶氨基酸序列（登录号:WP₀61527864.1）,经密码子优化设计合适大肠杆菌编码基因的DNA序列,在基因序列的两端分别添加限制性内切酶BamH I和限制性内切酶Sall I酶切位点,送由公司合成该基因。将融合表达载体pGEX-4T-3与合成的壳聚糖酶基因通过DNA T4连接酶连接,再转化到大肠杆菌中,构建重组菌株E.coil BL21-pGEX-4T-ChiA。2.利用生物信息学软件对Bacillus nakamurai壳聚糖酶进行分析,结果显示该壳聚糖酶基因长834bp,编码278个氨基酸,编码的蛋白属于GH46家族糖苷水解酶家族。等电点为8.87,分子量约为31.22KDa。二级结构预测发现该酶包括16个α螺旋,5个β折叠和一些无规则卷曲形状构成。预测壳聚糖酶的三级结构表明该壳聚糖酶主要结构呈哑铃状,有上、下两个结构域,由一段螺旋连接,其中有一个β-折叠与一些无规则卷曲组成的棍状结构在结构底部向外延伸。3.通过添加IPTG对重组蛋白诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测显示出一条约为31kDa的条带。为了提高蛋白表达量,对IPTG浓度,诱导温度和诱导时间进行优化,结果表明,在30℃、0.07mmoL/L IPTG、诱导6h为最优的蛋白表达条件。然后利用GST亲和层析的方法进行纯化,纯化得到的壳聚糖酶纯酶液浓度为10.932μg/mL。4.以脱乙酰度大于90%的壳聚糖为底物,采用DNS测定酶活力的方法测定重组壳聚糖酶的酶活,并对酶学性质进行了研究。结果显示:酶促反应的最适温度为37℃,在37℃下处理一个小时,剩余酶活在90%以上,在50℃处理20min酶活急剧下降,说明该酶在常温下有较好的稳定性;最适反应pH为4.5,在4⁵.5pH值范围内处理1h剩余酶活仍剩余80%以上,说明该酶在微酸性环境下有较好的活性和稳定性。在Ag⁺、Hg⁺离子存在的酶促反应中完全抑制壳聚糖酶的活性;Cu²⁺、Zn²⁺、Ni⁺、Fe³⁺在酶促反应中对壳聚糖酶的活性有部分抑制作用;而Mn²⁺、Ca²⁺对壳聚糖酶的酶活性有激活作用。K⁺、Na⁺、EDTA对壳聚糖酶的酶活性无明显影响。5.以小分子壳聚糖为底物,利用Autodock软件将壳聚糖与壳聚糖酶进行对接,分析底物与壳聚糖酶结合位点,根据自由结合能最低的分子对接构象确定最佳的结合位点。结果显示ARG73、ASP71、THE236、ASP238、PHE54、SER243、GIU239、LEV69氨基酸为最优的结合活性位点。进一步突变参与活性位点的氨基酸,随后通过Gromacs技术对复合物进行动力学模拟。通过分析复合物RMSD、回旋半径Rg、及氢键个数等参数来判断复合物构象的变化。结果得出ASP71突变后对复合物构象影响较大,不利于底物与酶的结合。