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主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是由一群位于脊椎动物特定染色体区域基因所编码的高度多态性蛋白分子。MHC分子分布于不同细胞表面,参与抗原呈递和调节免疫应答。不同种类动物MHC及其编码产物的名称各异。MHC分子家族中的Ⅱ类分子是由α、β两条链组成的异二聚体。在内质网中它与的γ链聚合,形成九聚体。九聚体中的γ链不同于α和β链,呈非多态性,因此被称为恒定链(Invariant chain,Ii)。Ii是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,白细胞分化抗原编号为CD74。作为MHCⅡ类分子的重要伴侣蛋白分子,Ii辅助MHCⅡ分子的正确折叠、组装、结构维持和协助呈递外源性抗原肽。在与MHCⅡ类分子的α、β链形成九聚体的过程中,其CLIP区(the class-Ⅱ associated Ii chain peptide)占据MHCⅡ类分子的抗原结合槽,阻止内源性抗原肽与MHCⅡ类分子结合。Ii与MHC分子的相互作用主要通过真核细胞和原核细胞表达系统进行研究。在真核表达中,通过共转染动物细胞表达,再用激光共聚焦和免疫共沉淀实验观察Ii与MHC分子的相互关系。由于在这两个分子间关系中,需要检测分子间亲和力关系,但是现有的动物真核细胞表达产物难以满足这类实验。为此,本研究探索应用原核表达系统大量表达目的蛋白,以此研究两种分子间的相互作用。首先,根据 GenBank 鸳鸯鸭 Mhc Ⅰα(登录号:AB115244)、Mhc Ⅱβ(DQ490138)和Ii(HQ909102)基因序列,利用自行设计的引物,再从鸳鸯鸭脾脏提取RNA,反转录得到其cDNA以其扩增出鸳鸯鸭Mhc Ⅰα、Mhc Ⅱβ和Ii基因的全长编码区域,将克隆的基因片段分别插入原核表达载体pET-32a和pGEX-4T-1中,以及真核表达载体pEGFP-N1和pmCherry-N1中,分别用于转化大肠杆菌Rosetta(DE3)和转染真核细胞表达真核蛋白。经PCR、酶切鉴定和测序结果表明成功构建6个重组质粒。其次,将重组质粒 pEGFP-N1-D-Mhc Ⅰα,pEGFP-N1-D-MhcⅡβ或pmCherry-N1-D-Ii分别转染293T细胞,观察它们在真核细胞中表达以及表达产物在细胞内的定位。结果表明,它们均能在细胞内表达,并分布于浆膜系统。再次,将原核表达产物分别经反复冻融和超声裂解处理,His/D-MHC Ⅰα和His/D-MHCⅡβ经镍离子亲和层析柱进行纯化,GST/D-Ii蛋白经GST亲和层析柱(Glutathione Sepharose 4B)进行蛋白纯化。在 SDS-PAGE 电泳中,His/D-MHC Ⅰα蛋白分子量为57.7 kD,His/D-MHCⅡβ蛋白分子量为46.7 kD,GST/D-Ii蛋白分子量为50.5 kD,GFP-D-MHCⅠα蛋白分子量为78.5 kD,GFP-D-MHCⅡβ蛋白分子量为60.5 kD,pmCherry-D-Ii蛋白分子量为24.5kD,其大小符合理论预期。最后,为检测原核表达的MHCⅠα、MHCⅡβ和Ii具有互相结合的功能,将PET-32a-D-MhcⅠα与 PET-32a-D-Mhc Ⅱβ和 pGEX-4T-1-D-Ii 分别转入大肠杆菌,经诱导表达以及纯化复性后,将MHC Ⅰα、MHC Ⅱβ分别与Ii混合孵育,镍离子亲和层析提取其中的复合物。结果表明,共表达产物经亲和柱提纯后,在未经SDS处理的PAGE中,出现复合物MHC Ⅰα/Ii和MHC Ⅱβ/Ii,再用SDS处理并进行电泳,发现在SDS-PAGE中这些复合物被解离成相应的2个单体条带。上述这些结果表明,鸳鸯鸭Mhc Ⅰα、Mhc Ⅱβ和Ii基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性,而原核共表达的MHC Ⅰα、MHC Ⅱβ和Ii蛋白分子复性后在Pull-down中表明它们互相结合。本研究的结果为进一步研究MHC Ⅰα、MHCⅡβ和Ii分子关系提供方法。