论文部分内容阅读
目的 探讨不同液化处理对痰液中病毒核酸共提取的影响并比较不同核酸共提取方法的优劣,建立一种简单实用的呼吸道标本核酸共提取的新方法及一种快速、敏感、特异性高的儿童呼吸道病毒多重 RT-qPCR(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)联检方法,用于同时检测不同核酸类型的呼吸道病原体,最后应用该联检体系检测杭州地区儿童急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)病毒感染情况。方法①采用加0.1%DTT、4%NaOH液化痰液,分别使用三种商业化核酸共提取试剂盒(方法一、二、三)和单一核酸提取试剂盒(方法四)提取核酸,应用微量核酸分析仪及多重定量PCR方法检测不同方法所提核酸的浓度。②以纳米磁珠为载体同时提取痰标本中的DNA和RNA,对提取方法中的磁珠用量、异硫氰酸胍浓度、DTT浓度、pH值、核酸释放时间及温度进行优化,采用多重定量PCR方法检测提取方法的质量,并与商业化的核酸共提取试剂盒对比。③设计腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人类偏肺病毒(HMPV)、流感病毒(INF)相对应的引物和AllGlo探针,利用正交设计对不同引物探针的用量、比例及酶量、模板量进行优化筛选,建立四重定量RT-PCR体系用以同时检测ADV、RSV、HMPV、INF,并对其特异性、灵敏度和重复性进行评价。④收集298例杭州地区ARTI儿童的痰标本,对常见呼吸道感染病原体进行检测,包括RSV、ADV、HMPV、INF、副流感病毒(PIV)、EB病毒(EBV)、细菌及肺炎支原体,比较单重/多重实时荧光定量PCR、直接免疫荧光方法检测RSV/ADV/INF阳性率的差异。结果①不同液化处理痰液病毒核酸共提取所得核酸荧光定量PCR结果:RSV(RNA)含量:生理盐水组>DTT处理组>NaOH处理组(F=152.76,P<0.05),不同试剂盒间比较,方法一>方法二>方法三,方法二与方法四之间差异无统计学意义(F=19.95,P<0.05);ADV(DNA)含量:生理盐水组>NaOH处理组,生理盐水组和DTT处理组间差异无统计学意义(F=382.53,P<0.05),不同试剂盒间比较,方法一>方法三,方法一、方法二与方法四之间差异无统计学意义(F=39.51,P<0.05)。②磁珠法共提取核酸组方筛选结果:异硫氰酸胍浓度为2mol/L,DTT(2mol/L)40μl磁珠量为20μl加热温度为60℃,pH值为8或9,加入助沉剂A。③四重定量PCR对ADV/RSV/HMPV/INF的检测下限均为10 Copies/μl,未出现非特异性扩增,重复性实验4种病毒扩增曲线Ct值平均值变异系数均小于5%。④单重定量PCR和多重定量PCR检测298份呼吸道标本病原体的结果一致,PCR与直接免疫荧光法用以检测RSV时一致性尚可(Kappa=0.317),两种方法检测ADV一致性轻微(Kappa=0.098)。结论①痰液液化方法对病毒核酸含量有损伤,其中DTT处理痰标本对病毒核酸含量损伤远小于用NaOH溶液处理,TIANamp Virus DNA/RNA共提取试剂盒提取痰标本中的病毒核酸效果较好。②磁珠核酸共提取法可从痰液中同时提取DNA和RNA,且提取率高,满足RT-PCR检测要求。③本研究建立的四重实时荧光定量RT-PCR可同时检测ADV/RSV/HMPV/INF,具有简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等特点。④儿童呼吸道感染常见病原体混合感染复杂常见,PCR技术检测病毒时阳性率高于直接免疫荧光法。