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目的慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）是一种造血祖细胞恶性增殖性血液系统肿瘤，目前耐药和复发仍然是CML的两大难题。近年来，随着DNA重组技术的发展，免疫毒素尤其是重组免疫毒素(recombinant immunotoxin, rIT)迅猛发展，已经成为肿瘤免疫治疗研究中的重点和热点。到目前为止，国内外已经有许多种免疫毒素试剂进入临床试验。在本研究中，我们制备了抗CML细胞人源化单链抗体（humanized single chain variable region fragment,hscFv)，并将其与截短了的假单胞菌外毒素基因（truncated pseudomonasexotoxin A, ETA′)融合来制备免疫毒素，对其进行了原核表达、纯化，并研究了其生物学活性，旨在为CML的靶向治疗提供一种高效的选择性的方法。方法1.将抗CML细胞hscFv片段插入到pET32a(+)原核表达载体中。将构建正确的pET32a-hscFv重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，在IPTG诱导下表达融合蛋白，表达产物用SDS-PAGE和WesternBlot进行鉴定；蛋白纯化后，采用细胞膜酶联免疫吸附试验（cellmembrane-enzyme linked immunosorbent asssay, CM-ELISA)和流式细胞术（flow cytometer, FCM)鉴定hscFv融合蛋白的抗原结合特性。2.将hscFv与ETA′基因通过酶切与连接反应，在pWW20载体上构建hscFv-ETA’免疫毒素基因；再将其亚克隆入pET32a(+)中，转化BL21（DH3）宿主菌，IPTG诱导融合蛋白表达；SDS-PAGE和WesternBlot实验观察目的蛋白的表达情况并对纯化后的目的蛋白进行鉴定。CM-ELISA和FCM鉴定融合蛋白的抗原结合特性。通过细胞增殖实验（MTT)、细胞凋亡实验等来探讨hscFv-ETA’融合蛋白对CML细胞株和患者细胞的靶向杀伤作用。结果1.本研究成功构建了hscFv的重组原核表达载体；该蛋白在25℃、l mM IPTG诱导4h的条件下获得高效、可溶性的表达；经纯化获得了高纯度的hscFv融合蛋白; CM-ELISA、FCM实验证实该蛋白具有CML细胞表面抗原结合的特性。2.成功构建了hscFv-ETA’重组原核表达载体；hscFv-ETA’融合蛋白在23℃、l mM IPTG诱导6h的条件下获得可溶性表达；经Ni2+-NTA亲和纯化获得了hscFv-ETA’融合蛋白；经CM-ELISA、FCM等实验证实了该融合蛋白具有CML细胞表面抗原结合的特性；凋亡实验证明了该融合蛋白对CML细胞株或者患者细胞具有明显的靶向杀伤能力。结论本研究成功制备、表达了hscFv蛋白和hscFv-ETA’重组免疫毒素，通过一系列的试验证明了制备的hscFv和hscFv-ETA’具有与CML细胞结合的活性并且hscFv-ETA’能特异性地靶向杀伤CML细胞，为慢性粒细胞白血病的靶向治疗提供了新的免疫学方法。