论文部分内容阅读
背景与目的:癌性疼痛是癌症患者最常见和最难以忍受的症状之一,严重影响了患者的生存质量。目前临床上对于癌痛患者的治疗主要还是依据世界卫生组织(WHO)的三阶梯疗法,但仍有20%-40%的病人疼痛未得到控制。骨癌性疼痛更是临床上难以控制和治疗的疾病之一。rBmK-AGAP是从蝎毒中分离重组出来的一种蝎毒多肽单体,具有抗肿瘤和镇痛的作用,但其对于癌性疼痛的作用,目前还没有研究。除此之外,有研究表明胶质细胞的活化,NF-κB信号通路的激活参与到了骨癌痛的发生发展和维持。本研究通过建立大鼠胫骨癌痛前临床模型,旨在探索rBmK-AGAP是否具有抑制骨癌痛的作用,以及其机制是否同胶质细胞的活化、NF-κB信号通路的激活有关。方法:1.随机将大鼠分为以下四组:假手术组(Sham+Veh)、假手术给药组(Sham+AGAP)、骨癌痛组(BCP+Veh)、骨癌痛给药组(BCP+AGAP),根据文献中的方法进行手术,建立大鼠胫骨癌痛前临床模型。分别在术前,术后第3、5、7、9、11、13天检测大鼠机械性痛阈值和自发后肢应用评分,量化评估大鼠疼痛行为。在大鼠出现疼痛行为学后,给予rBmK-AGAP(0.05mg/kg)腹腔注射。同时测量大鼠体重,以反映大鼠的生存状态。2.在术后第13天,对大鼠胫骨进行X线拍摄,以反映骨质破坏程度,同时侧面验证大鼠胫骨癌痛模型的建立是否成功。3.提取各组大鼠的脊髓组织,分别进行蛋白提取和冰冻切片处理,通过蛋白印迹实验和免疫荧光实验,检测不同组之间GFAP、Iba-1、P-P65、P65、IκBα、P-IKKα的表达水平,以及荧光强度和胶质细胞的表型变化,以确定胶质细胞的活化和NF-κB信号通路激活情况。通过免疫荧光双染实验,确认NF-κB信号通路激活的特定细胞类型。4.提取大鼠血液样本,通过ELISA实验,检测不同组之间炎症因子IL-6、IL-1β的表达水平。5.提取大鼠星形胶质细胞,通过TNFα因子活化星形胶质细胞后,加药处理,提取总蛋白,检测rBmK-AGAP在体外是否可以抑制NF-κB信号通路的激活。结果:1.在术后第7天,胫骨骨髓腔内接种肿瘤细胞的大鼠同假手术组和假手术给药组的大鼠相比,机械性痛阈值、后肢应用评分明显降低。骨癌痛给药组同骨癌痛组相比,给药后30分钟至1小时镇痛效果最好,连续给药7天,rBmK-AGAP具有抑制大鼠疼痛行为学的作用,但对正常大鼠的基础机械性痛阈值没有影响。至课题结束日,四组大鼠之间体重无明显差异。2.在术后第13天,课题结束日,对大鼠胫骨进行X线拍摄,结果显示,同正常大鼠相比,接种肿瘤细胞的两组大鼠均出现了不同程度的骨质破坏。根据三点式量化评分表,分析骨质破坏情况,结果显示rBmK-AGAP对骨质破坏程度并没有影响,差异无统计学意义。3.通过蛋白印迹和免疫荧光实验,我们可知,骨癌痛组同假手术组和假手术给药组相比,GFAP、Iba-1表达增多,荧光强度增强,且星形胶质细胞和小胶质细胞数目增多,胞体肥大。rBmK-AGAP可以减少GFAP的表达水平,抑制星形胶质细胞的表型变化。4.rBmK-AGAP可以抑制脊髓内P-P65、P-IKKα的表达水平,抑制NF-κB信号通路的激活。后又通过免疫荧光双染实验证明了特定的细胞类型。rBmK-AGAP可以抑制星形胶质细胞和神经元内的NF-κB的激活。5.通过ELISA实验证明,rBmK-AGAP可以抑制炎症因子IL-6、IL-1β的表达水平。6.通过体外星形胶质细胞原代培养进行体外实验,进一步证明了,rBmK-AGAP可以在体外抑制星形胶质细胞内NF-κB信号通路的激活。结论:本课题在骨癌痛模型的基础上证实了rBmK-AGAP具有减轻大鼠胫骨癌痛行为的作用,其机制同抑制NF-κB信号通路的激活,抑制脊髓内星形胶质的活化有关。除此之外,体外实验也证实rBmK-AGAP可以抑制星形胶质细胞内的NF-κB信号通路的激活。