黄曲霉毒素生防细菌的分子鉴定及其抑毒活性物质研究

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本文对已筛选获得的能抑制黄曲霉毒素生物合成途径中第一个稳定中间产物Norsolorinic acid(NA)产生的,并且拥有我国自主知识产权的生防细菌Hitwh-B05菌株进行16S rDNA分子鉴定、形态生理特征和产生抑毒活性物质性状的遗传稳定性、发酵适宜温度、抑毒活性物质的有效保藏期等方面进行研究,并初步建立提取纯化其发酵产生的抑毒活性物质的方法,为进一步纯化、鉴定抑毒活性物质、探明其抑制NA继而抑制黄曲霉毒素产生的机理打下基础。通过对Hitwh-B05菌株的形态生理特征和16S rDNA鉴定,明确其为芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌,该菌株产生抑毒活性物质的能力具有良好的遗传稳定性(至少可稳定遗传10代),连续转接10代中发酵上清液对寄生曲霉NA突变株产生NA的抑制率均为100%,而对菌丝体生长的抑制率为75%~98.7%。该菌株适宜的发酵温度为35℃,发酵上清液对菌丝体生长的抑制率为76.32%以上,对NA产生的抑制率则可达到100%。而发酵上清液保存时间在一年以内不会影响其中的抑毒活性物质的稳定性,保存0天、保存半年和保存一年的发酵上清液对NA产生的抑制率均为100%,对菌丝体生长的抑制率分别为84.78%、98.04%和92.96%,t检验表明与对照差异不显著;利用寄生曲霉产毒菌株进行研究表明,能完全抑制NA产生的发酵液同样能完全抑制黄曲霉毒素的产生。用不同极性有机溶剂对Hitwh-B05菌株发酵上清液中抑毒活性物质的提取与纯化方面的研究表明,除氯仿提取物仅对寄生曲霉NA突变株的菌丝体生长有抑制效果外,苯、乙酸乙酯和正丁醇提取物对菌丝体生长和NA产生均有较好的抑制效果,对菌丝体生长的IC50分别为苯1.218mg/ml,乙酸乙酯0.075mg/ml ,正丁醇0.530mg/ml ,对NA产生的IC50分别为苯0.481mg/ml,乙酸乙酯0.029mg/ml,正丁醇0.318mg/ml,这表明Hitwh-B05菌株发酵上清液中含有多种类的抑毒活性物质,并且可初步判断抑制效果较好的抑毒活性物质的极性较高。对乙酸乙酯和正丁醇的提取物通过薄层层析进一步纯化,分别获得14和13条区带,通过微孔板培养结果表明,对寄生曲霉NA突变株产生NA有较好抑制作用的区带总数分别为5条和7条。乙酸乙酯提取物对NA的产生有抑制作用的分离区带中,带9浓度在0.3mg/ml时能够完全抑制NA的产生,带11、12、13和14浓度在0.075mg/ml时就能够完全抑制NA的产生,而对菌丝体生长则没有明显的抑制作用,即使当浓度达到0.3mg/ml时,对菌丝生长也未表现出明显的抑制作用。正丁醇分离区带中抑制效果最好的为带1,Tip culture结果表明,区带1在0.05mg/ml浓度下可完全抑制NA的产生,而对菌丝生长的抑制率可达32.20%,微孔板实验中,当其浓度达1.0mg/ml时能完全抑制寄生曲霉孢子的萌发。本研究结果表明了Hitwh-B05菌株为一优良的生防细菌新菌株,对其发酵产生的抑毒活性物质进一步分离纯化及进行结构鉴定将为黄曲霉毒素污染的生物防治提供新的先导化合物和生物新农药。
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