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研究背景放射性肠炎(Radiation Enteritis,RE)是由于腹盆腔及腹膜后恶性肿瘤患者,经射线(X线、γ射线等)放射治疗后引起的肠道损害,可累及小肠、结肠和直肠。临床上分为急性和慢性损伤,能够引起患者腹痛、腹泻,便秘,还可导致肠梗阻、肠瘘,甚至引起患者死亡,严重影响患者的生活质量。该病在国内外发生率均较高,且呈逐年上升趋势。射线导致损伤的主要因素之一是氧自由基过量产生,大量氧自由基可引起细胞功能损伤的发生并引发级联反应导致细胞凋亡,Nrf2/ARE是机体免受氧化应激损伤最重要的信号通路,该信号通路已被证实在肝、肺、肾等多组织中能够保护组织免受氧自由基损伤而产生保护作用,但对于放射性肠损伤鲜有报道,目前针对X射线诱导放射性肠损伤的研究多来自临床病例观察,损伤机制尚不清楚,围绕其发病机制的实验性研究较少,导致目前实验研究较少的主要原因是缺乏适宜的实验模型。因此,对于放射性肠损伤实验建模条件的摸索,是本课题首要研究内容,其次,Nrf2/ARE信号通路是否在肠道组织中具有保护作用及其作用机制是本课题研究的重点。研究目的1.通过摸索建立RE模型的最佳条件,建立符合临床病理特征的急性放射性肠损伤的动物和细胞模型,为放射性肠损伤的机制探索及有效治疗药物的研发奠定基础。2.通过研究Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的动态表达和分布情况,明确该信号通路与放射性肠损伤的关系及作用。3.通过选择性干预调控Nrf2/ARE信号通路的基因表达,初步探索Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的保护作用及其分子机制,为临床治疗放射性肠损伤提供新的靶点及思路。研究方法1.采用雄性SD大鼠及IEC-6细胞株,以不同辐射剂量的6MV-X射线单剂量照射大鼠及细胞,(1)动物模型:在整体动物学方面观察大鼠死亡情况、进食进水量、体重变化、腹泻情况,H&E检测肠黏膜组织损伤情况,采用试剂盒检测空肠组织氧化应激指标(SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性)的变化,免疫组化和免疫印迹检测空肠组织中凋亡蛋白NF-κB的表达;(2)细胞模型:采用CCK-8法检测细胞活力,最终筛选出最佳照射剂量及观察时间点,并建立放射性肠损伤动物及细胞模型条件。2.(1)Nrf2/ARE信号通路在放射性空肠组织中的动态表达和分布情况:采用雄性SD大鼠随机分为正常对照组和10Gy照射剂量组,分别在照射前及照射后1h、6h、12h、24h、48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h、168h处死大鼠,观察不同时间点大鼠肠道损伤及H&E染色分析肠黏膜动态改变情况,qPCR法和Western Blot法检测肠组织中Nrf2及其下游分子HO-1 mRNA及蛋白动态表达情况,免疫组化检测照射后48h Nrf2和HO-1蛋白表达;(2)Nrf2/ARE的作用及意义:采用IEC-6细胞株,Nrf2抑制剂抑制细胞中Nrf2 mRNA的表达,CCK-8法检测细胞活力、Hoechst33258检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞内ROS的变化、SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性等氧化应激指标,进一步明确Nrf2的在辐射性肠损伤中的作用及意义;(3)采用全转录组基因测序分析正常大鼠与10Gy照射大鼠空肠组织全基因变化及与Nrf2相关基因差异。3.探索Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中的保护作用及其分子机制:采用P38MAPK抑制剂、ERK抑制剂、PI3K抑制剂分别对IEC-6细胞进行干预,检测不同干预组正常细胞与照射后细胞细胞活力、氧自由基、细胞凋亡及Nrf2蛋白和mRNA表达情况。研究结果1.(1)急性放射性肠损伤动物模型的建立:结果表明:照射剂量为6Gy以下时,大鼠整体动物学、氧化应激、组织病理学等各项指标变化与正常大鼠比无显著差异,照射剂量6Gy以上,随着照射剂量的增加,大鼠肠损伤显著加重,照射剂量为12Gy时,大鼠生存率仅为20%,随着照射后观察时间的推移,大鼠在照射后72h损伤最严重,84h后逐渐恢复。综合考量各项指标,10Gy照射剂量可以复制出与临床放射性肠炎症状相似的动物模型,其肠黏膜组织病理学、氧化应激及NF-κB等指标可以得出在照射后72h损伤最严重,故建立急性放射性肠损伤动物模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,源皮距100cm,观察时间点为照射后72h。(2)急性放射性肠损伤细胞模型的建立:结果表明:CCK-8细胞活力实验表明,8Gy照射细胞,细胞形态及细胞活力与正常组比较无显著差异;12Gy照射细胞,80%细胞发生核皱缩,细胞裂解死亡;而10Gy照射剂量的细胞,在照射后48h损伤最显著,细胞形态改变,细胞死亡率为50%,细胞活力降低50%,与正常细胞比较即有差异又有50%的生存率和活力。故建立急性放射性肠损伤细胞模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,细胞至放射源的距离为100cm,观察时间点为照射后24h。2.(1)Nrf2在大鼠RE中的动态变化及表达研究,结果表明:大鼠肠道损伤随照射后时间的延长而加重,照射后72h肠损伤最为显著,肠道水肿充血、肠黏膜肿胀、绒毛变短;Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达均在照射后1h显著升高,分别在照射后48h及12h达到峰值,照射后72h及24h表达有所回落,但与正常组比较仍存在显著差异;(2)Nrf2在大鼠RE中的保护作用研究,结果表明:给予Nrf2抑制剂干预后,肠上皮细胞与单一照射组比较损伤显著加重,细胞活力下降,ROS含量和细胞凋亡显著增加,氧化应激反应显著升高;(3)全转录组基因测序分析实验,结果表明:模型组大鼠有5284种基因发生改变,其中有300余种基因发生显著变化,综合分析与Nrf2相关基因,其中HO-1、MAPK、ERK及PI3K途径均有显著改变。3.探索Nrf2/ARE信号通路在RE中的保护作用及其分子机制,结果表明:不同抑制剂干预Nrf2上游途径后,与照射组(IR)比较,IEC-6辐射损伤细胞中,MAPK抑制剂组和ERK抑制剂组细胞活力、氧自由基、细胞凋亡,Nrf2蛋白和mRNA表达变化均无统计学意义,而PI3K抑制剂干预组损伤显著,细胞活力显著降低,氧自由基和细胞显著增加,Nrf2 mRNA和核蛋白表达均显著降低。研究结论1.(1)模拟临床放射性肠损伤动物模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,源皮距为100cm,观察时间点为照射后72h;(2)放射性肠损伤细胞模型的条件为:6MV-X射线医用型直线加速器,400mu/min剂量率,10Gy照射剂量单次照射,细胞至放射源的距离为100cm,观察时间点为照射后24h。2.(1)Nrf2/ARE信号通路在放射性肠损伤中具有重要的保护作用,该通路在损伤早期(照射后1h)被激活,照射后48h表达最高;并上调了其下游的抗氧化和解毒酶HO-1水平;(2)Nrf2是辐射性肠损伤的自保护机制,抑制Nrf2途径后,辐射性肠损伤显著增加。3.PI3K/Akt途径在辐射性肠损伤Nrf2/OH-1途径的激活中发挥主要作用