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Ⅰ.H5亚型禽流感病毒HA基因突变影响其细胞融合胰酶依赖性的研究H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)已在全球导致604例直接感染人类病例,病死率高达60%,对全球公共卫生构成了严重威胁。H5N1亚型HPAIV具有高度的变异性和广泛的宿主性。HPAIV在不同禽类宿主间传播、复制、进化、变异,导致宿主侵嗜性、致病性及传播能力的改变。H5N1禽流感任何获得直接感染哺乳动物乃至人类能力的分子机制仍未得到充分阐明。H5N1亚型HPAIV分离株A/BHG/Qinghai/3/2005(clade2.3)(QH)和A/CK/Shanxi/2/2006(clade7)(SX)对鸡均表现为高致病性,但对小鼠致病力差异显著,QH为高致病力,SX为低致病性。为探讨致病力差异的分子机制,对两株病毒的HA进行细胞融合活性的比较。结果显示,QH株HA(QH-HA)可在人源Hela和A549细胞及禽源Df-1细胞上引起的细胞融合显著强于SX株HA(SX-HA)。通过对大量H5亚型HA基因序列分析比较,发现HA蛋白第90位P是一个保守位点。QH株HA(QH-HA)90位为P,而SX株HA (SX-HA)为S(P到S的突变可形成一个潜在的糖基化位点)。因此,将QH-HA的90位点突变为S,构成QH-HA90PS。在添加外源胰酶时,OH-HA与QH-HA90PS在所有细胞均能被裂解为HA1与HA2,二者均具有融合活性。当不提供外源胰酶时,QH-HA与QH-HA90PS同样都能被裂解为HA1与HA2,但令人意外的是,QH-HA90PS在人源Hela和A549细胞中失去融合活性。将SX-HA的90位S突变为P,构成SX-HA90SP,则无论添加胰酶与否,SX-HA与SX-HA90SP在上述三种细胞上均能被裂解为HA1与HA2,融合活性均无显著差异。进一步将野生型QH-HA和SX-HA裂解位点的连续多个碱性基氨基酸序列(分别为GERRRKKR和REGGRRKR)突变为低致病力形式的RETR,分别构成QH-HAc90PS和SX-HAc90SP。结果,显示在未加外源胰酶的情况下,QH-HAc90PS在Hela、A549和DF-1均不能被裂解为HA1和HA2,且失去细胞融合活性。出乎意料的是,SX-HAc90SP在未加外源胰酶时,仍可被裂解为HA1和HA2,并在上述细胞上均具有融合活性。为了进一步了解HA基因90位氨基酸突变对QH和SX病毒生物学特性的影响,利用流感病毒反向遗传操作系统,分别构建了A/BGH/QingHai/3/2005为背景的3株点突变病毒QH-HA-90PS、 QH-HA90PA和QH-HA88NQ;以及A/CK/Shanxi/2/2006为背景的3株点突变病毒SX-HA-90SP、 SX-HAc和SX-HAc90SP。 QH-HA、QH-HA90PA、QH-HA88NQ和SX-HA、SX-HA90SP、 SX-HAc90SP在不添加胰酶的情况下均可在DF-1、MDCK、A549上复制；而QH-HA90PS和SX-HAc则需要添加外源胰酶才能在这三种细胞上复制。小鼠感染实验显示：尽管90位点P-S的突变导致重组病毒的致病力有所减弱,但差异不显著。本研究结果显示,H5N1HPAIV的HA基因第90保守位点的突变可对其细胞融合功能的胰酶依赖性产生显著影响。这一结果为解释H5亚型HPAIV感染与致病机制提供了新的线索。II.尼帕脑炎重组新城疫病毒活载体疫苗的研究尼帕脑炎是由尼帕病毒(Nipah Virus, NiV)引起的一种烈性人畜共患病,人类感染死亡率达40%以上。NiV自然宿主为果蝠,在东南亚、南亚及我国南方地区广泛分布。猪对NiV极为敏感,尽管感染后死亡率低,但可通过天然孔大量排泄病毒,是NiV传播的中间和放大宿主。我国生猪养殖量大,猪一旦与带毒果蝠接触,极有可能成为人类的传染源。研制安全、有效的猪用尼帕疫苗具有重要意义。尼帕病毒(Nipah virus,NiV),属于副粘病毒科,囊膜糖蛋白G和F为其诱导保护性中和抗体的主要免疫原。新城疫病毒是一种非常具有应用前景的活病毒疫苗载体。本研究利用新城疫弱毒Lasota株为载体,利用反向遗传操作技术,分别构建了表达NiV的G和F蛋白的重组新城疫病毒:rLa-NiVG和rLa-NiVF。重组病毒rLa-NiVG和rLa-NiVF均具有在鸡胚的高滴度生长特性；鸡胚平均致死时间(MDT),脑内致病指数(ICPI)及静脉内致病指数(IVPI)与亲本LaSota株一致。rLa-NiVG和rLa-NiVF经脑内与肌肉途径接种3周龄小鼠,对体重及存活影响与LaSota株无显著差异。rLa-NiVG和rLa-NiVF接种小鼠,可诱导产生显著的NiV特异性中和抗体,以及针对F蛋白表位特异性的CD8+T细胞免疫反应。更为重要的是,rLa-NiVG和rLa-NiVF无论单独或联合免疫,均可在接种猪体内诱导产生显著而和持久的NiV中和抗体。结果表明,rLa-NiVG和rLa-NiVF具有良好的生物安全性和免疫原性,作为预防NiV候选疫苗,具有良好的应用前景。