基于噬菌体和碳点的致病菌快速检测

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由细菌感染所引发的疾病,是当今世界上出现最多、传播最广的疾病之一。虽然各国均已高度重视对致病菌的预防和控制,但致病菌爆发的事件还是屡有发生,严重威胁着人类和社会的安全。传统的平板培养菌落计数法是一种可靠的检测致病菌的方法,但检测周期较长。分子生物学和免疫学的检测方法使检测时间大大缩短,但需要专业的设备和技术人员,且容易出现假阳性结果。因此,迫切需要研发一种更加高效快速、准确度高、成本低的方法,以实现对致病菌的快速可靠检测。本论文基于噬菌体和碳点,构建了针对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,Y.pseudotuberculosis)的快速检测体系,具体内容如下:(1)利用细菌新陈代谢产生酸性产物的原理,设计并合成了一种基于碳量子点的p H荧光探针,将其应用于E.coli O157:H7的快速检测。利用基质辅助激光脱附飞行质谱技术进一步鉴定所检测的细菌,最终达到识别并定量检测的目的。该方法用于检测E.coli O157:H7时,检测范围为13~1.33×10~5 CFU/m L,检测限为1 CFU/m L。(2)将噬菌体和酶引入到检测体系中可以增强检测方法的特异性,降低检测时间,由此开发了一种基于噬菌体和Au Pt纳米酶比色检测Y.pseudotuberculosis的新方法。从医院污水中分离获得的特异性噬菌体可以大量扩增,成本较低。通过HAu Cl4和H2Pt Cl6共还原合成的Au Pt纳米颗粒具有优异的类过氧化物酶活性。将该噬菌体偶联到磁珠上,与固定了Au Pt颗粒的噬菌体,共同捕获Y.pseudotuberculosis,形成“夹心结构”,Au Pt催化TMB的氧化,生成黄色产物,通过比色分析,实现对Y.pseudotuberculosis的快速特异性检测。该方法检测限为14 CFU/m L,检测时间为40min。(3)在实际检测中,比色传感检测易受有颜色样品的干扰,而电化学传感器则不受影响,由此本论文设计了一种基于噬菌体和PI-5-CA/r GO/Au NPs的电化学生物传感器,用于对Y.pseudotuberculosis的快速、特异性检测。合成的PI?5?CA/r GO/Au NPs材料,具有超高的氧化还原稳定性和优越的导电率,大大提高了电化学传感器的检测灵敏度。该电化学传感器用于检测Y.pseudotuberculosis,检测限为3CFU/m L,检测时间为35 min,具有良好的特异性、存储稳定性和重现性。(4)将高效催化的酶引入到噬菌体电化学传感器中可以进一步提升检测性能,本论文利用T4噬菌体展示技术将β-半乳糖苷酶固定在T4噬菌体衣壳表面,并将其应用于电化学传感器的制备,实现对E.coli K12的快速、特异性检测。噬菌体展示的酶相较于游离酶在稳定性方面有不同程度的提升。将展示酶的T4噬菌体用于制备电化学传感器,捕获E.coli K12,通过β-半乳糖苷酶催化底物产生电活性物质来达到检测的目的。检测范围为1.50×10~2~1.50×10~7 CFU/m L,检测限为2 CFU/m L。抗体和T4作为双重识别探针保证了检测的特异性;β-半乳糖苷酶作为信号探针保证了检测的灵敏性。综上,本论文成功构建了一系列传感检测体系,实现了对病原菌的快速、特异性检测,这些方法在食品、环境和临床检测方面有着巨大的应用前景。
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