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拟除虫菊酯类(pyrethroid,PD)农药是20世纪70年代迅速发展起来的新型农药,具有高效、低毒、在哺乳动物体内代谢和排泄迅速、坏境中残留较少等特点,而广泛用于防治农业、林业及家庭中的害虫。
PD作为神经毒物,其广泛使用所造成的神经毒性的研究已成为农药毒理学和神经毒理学研究的热点。神经递质是突触传递的重要组成成分,神经递质代谢的异常可严重干扰突触内信息的传递,继而严重影响神经系统的功能与动物行为。有学者认为,PD可调节突触前膜多种神经递质的释放和突触后膜神经递质功能。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是脑内主要的抑制性神经递质,广泛分布于整个神经系统中,它能介导抑制性突触传递作用,从而防止脑内神经元过度兴奋,GABA系统功能失调可导致中枢神经系统功能的异常和焦虑管理失调。在动物体内,脑组织中的GABA含量稳定,先是谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸(gluta-mate,Glu)生成GABA,生成的GABA再经过γ-氨基丁酸转氨酶(GABA transaminase,GABA-T)的催化生成琥珀酸半醛,同时生成Glu,如此形成环路,保持GABA系统的稳定,从而维持中枢神经系统的正常功能。由此可见,谷氨酸脱羧酶和GABA-T对维持GABA的功能起着重要的作用。有文献报道溴氰菊酯染毒大鼠,其脑组织GABA浓度明显升高;低剂量的丙烯菊酯可使海马GABA水平下降,而高剂量丙烯菊酯则可使海马GABA的水平上升;一次性经口给予溴氰菊酯,大鼠大脑皮层、海马和小脑的GABA-T活力下降。我们以往的研究发现,乙体氯氰菊酯染毒小鼠2h后,经分光光度法检测小鼠脑组织GABA水平增高、谷氨酸脱羧酶活性未见明显变化,GABA-T活性下降,PD对GABA影响的详细作用机制尚不清楚。
神经递质释放到突触问隙后要与突触后膜上相应的受体结合才能发挥效应。GABA主要通过GABA-A、GABA-B、GABA-C三种亚型受体介导生理效应,而目前,关于PD对GABA受体影响的研究未见报道。
乙体氯氰菊酯又名高效氯氰菊酯,是目前应用较为广泛的Ⅱ型拟除虫菊酯农药,本研究采用急性乙体氯氰菊酯染毒小鼠,应用高效液相色谱法对小鼠脑组织GABA含量进行测定,进一步证实PD对GABA的影响,并结合对GABA-T蛋白表达、GABA受体(GABA-AR,GAB-BR)mRNA水平影响的研究,探讨乙体氯氰菊酯的神经毒性及作用机制,为该类农药的中毒防治提供重要的理论依据。
材料与方法:
一、动物分组、处理及样品采集
健康成年昆明种小鼠80只,体重18-22g。按体重随机分为1个对照组及3个染毒组,每组20只,雌雄各半。隔夜禁食后,染毒组小鼠以一次经口灌胃方式分别给予20、40、80mg/kg剂量的乙体氯氰菊酯,灌胃量为0.2ml/10g体重。以食用色拉油稀释受试物质,对照组给予等量色拉油。实验期间小鼠自由饮水、摄食。室内温度22±2℃,相对湿度55±5%,保持动物室通风良好。分别于染毒后2h、4h乙醚麻醉,在冰盒上迅速分离小鼠脑组织,一侧脑组织用于测定GABA含量,另一侧脑组织用于测定GABA受体mRNA表达。再按上述同样方法,于灌胃后2h测定脑组织GABA-T蛋白表达,每组6只小鼠。
二、观察指标及检测方法
(一)症状观察
染毒后连续观察并记录小鼠中毒症状、中毒表现的时间及死亡情况。
(二)GABA含量
参照文献应用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法测定脑组织GABA含量。
(三)GABA-T的蛋白表达
取小鼠脑组织采用免疫组织化学法测定GABA-T的蛋白表达,采用图像分析系统对图像进行积分光密度(integral optical density,IOD)分析。
(四)GABA受体的mRNA表达
用TRIzol试剂提取脑组织中的总RNA,按Real-time PCR试剂盒说明逆转录并扩增,分析结果。
三、统计分析
计量资料用-x±s表示,用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,组间两两比较用LSD法,检验水准a=0.05。
结果:
一、症状观察
80mg/kg剂量组全部小鼠于染毒1h后出现舔身、躁动、抓搔等症状;染毒2h后陆续出现流涎、痉挛、步态不稳、共济失调等中毒症状,而后出现少动或行动迟缓。40mg/kg剂量组个别小鼠于染毒2h后出现舔身、抓搔等症状。20mg/kg剂量组小鼠在整个受试期间未见异常。实验期间无动物死亡。
二、GABA含量
染毒2h后,各组小鼠脑组织GABA含量随染毒剂量的增加而逐渐增加,80mg/kg剂量组小鼠脑组织GABA含量明显高于对照组(p<0.05);染毒4h后,80mg/kg剂量组小鼠脑组织GABA含量明显高于其他三组(p<0.05)。
三、GABA-T的蛋白表达
染毒2h后,各染毒组小鼠脑组织GABA-T蛋白表达的IOD值与对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。
四、GABA受体的mRNA表达
染毒2h后,各染毒组小鼠脑组织GABA-AR、GABA-BRmRNA表达与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05);染毒4h后,各染毒组小鼠脑组织GABA-BRmRNA表达有下降趋势,但差异无统计学意义(p>0.05),80mg/kg剂量组小鼠脑组织GABA-ARmRNA表达明显低于对照组(p<0.05)。
结论:
乙体氯氰菊酯可使小鼠脑组织γ-氨基丁酸的含量增加,反馈性抑制GABA-A受体mRNA表达,使GABA系统功能失调,导致中枢神经系统功能的异常。