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A型流感病毒(Influenza A virus,LAV)是严重威胁人类健康的病原体,可造成季节性流行和潜在大流行。根据病毒包膜表面糖蛋白血凝素(haemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性不同,IAV可被分为不同亚型。IAV的基因组由8个单链负义的不同vRNA片段组成。每一vRNA片段由位于中间的编码区与两端的非编码区(noncoding region,NCR)组成。每一端的非编码区又由位于最末端的高度保守的启动子区与毗邻的非保守非编码区组成。之前的研究表明,非保守非编码区,在不同流感病毒株的同一种vRNA片段中,存在长度和序列的高度保守。因此,非保守非编码区又被称为片段特异性非编码区(segment-specific NCR,ssNCR)。
我们的前期研究发现,ssNCR在HA片段和NA片段中,也呈现亚型特异性,是亚型特异性非编码区(subtype-specific NCR,ssNCR)。不同HA或NA亚型的ssNCR在长度和序列上存在差异,同一HA或NA亚型的ssNCR相对保守。前期研究还发现,HAssNCR的长度和序列差异可以通过影响HA片段的包装效率进而影响病毒的复制效率。
本研究中,我们深入研究了3端H1-ssNCR的长度对A型流感病毒复制的影响。我们对3端H1-ssNCR进行截短,并通过反向遗传学系统及小型复制子系统,分别比较了重组病毒的复制效率与HAvRNA转录及复制的能力。结果表明,3端H1-ssNCR的截短显著影响了重组病毒的复制效率,造成病毒复制能力的下降。3端H1-ssNCR的截短在单一HAvRNA模板存在的小型复制子系统中,不影响HAvRNA的复制能力。然而,当多个不同的vRNA模板存在时,3端H1-ssNCR截短的HAvRNA的复制能力显著降低。通过对3端H1-ssNCR截短的重组病毒进行传代,我们在HAvRNA的编码区发现了一个适应性点突变G76A。该G76A突变可以显著提高3端H1-ssNCR截短的HAvRNA的复制能力及重组病毒的复制效率。由于G76A突变使HA蛋白质序列中的第15位氨基酸从苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile),我们构建了表达异亮氨酸的密码子突变。我们发现当3端H1-ssNCR截短,编码区的不同异亮氨酸密码子可以不同程度地影响HAvRNA的复制能力和重组病毒的复制效率。这些结果表明,HAvRNA的3端非编码区与毗邻的编码区相互作用,调节HAvRNA的复制能力,造成重组病毒的复制效率差异。
我们也对5端H1-ssNCR进行了截短,发现5端H1-ssNCR的长度也可以调节重组病毒的复制能力。重组病毒的复制效率随5端H1-ssNCR的缩短而降低。我们还对H1-ssNCR的序列要求进行了初步研究。通过人为引入随机序列和构建随机核苷酸选择库的方法发现,H1-ssNCR中AU核苷酸含量高有利于病毒的复制。H1-ssNCR的不同区域对序列的要求不同。不同位置上的核苷酸相互作用,影响病毒的复制能力。
总之,本研究揭示了H1-ssNCR对病毒复制的重要性。我们证明了启动子区域以外的非编码区序列也可以影响HAvRNA的复制,进而调节病毒的复制效率。3端H1-ssNCR与毗邻的编码区共同作用,调节HAvRNA的复制能力。H1-ssNCR的长度和序列都对病毒的复制效率有重要影响。本课题研究丰富了我们对H1-ssNCR的认识,为其他亚型的HAssNCR的研究以及非编码区RNA的研究提供了坚实基础。
我们的前期研究发现,ssNCR在HA片段和NA片段中,也呈现亚型特异性,是亚型特异性非编码区(subtype-specific NCR,ssNCR)。不同HA或NA亚型的ssNCR在长度和序列上存在差异,同一HA或NA亚型的ssNCR相对保守。前期研究还发现,HAssNCR的长度和序列差异可以通过影响HA片段的包装效率进而影响病毒的复制效率。
本研究中,我们深入研究了3端H1-ssNCR的长度对A型流感病毒复制的影响。我们对3端H1-ssNCR进行截短,并通过反向遗传学系统及小型复制子系统,分别比较了重组病毒的复制效率与HAvRNA转录及复制的能力。结果表明,3端H1-ssNCR的截短显著影响了重组病毒的复制效率,造成病毒复制能力的下降。3端H1-ssNCR的截短在单一HAvRNA模板存在的小型复制子系统中,不影响HAvRNA的复制能力。然而,当多个不同的vRNA模板存在时,3端H1-ssNCR截短的HAvRNA的复制能力显著降低。通过对3端H1-ssNCR截短的重组病毒进行传代,我们在HAvRNA的编码区发现了一个适应性点突变G76A。该G76A突变可以显著提高3端H1-ssNCR截短的HAvRNA的复制能力及重组病毒的复制效率。由于G76A突变使HA蛋白质序列中的第15位氨基酸从苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile),我们构建了表达异亮氨酸的密码子突变。我们发现当3端H1-ssNCR截短,编码区的不同异亮氨酸密码子可以不同程度地影响HAvRNA的复制能力和重组病毒的复制效率。这些结果表明,HAvRNA的3端非编码区与毗邻的编码区相互作用,调节HAvRNA的复制能力,造成重组病毒的复制效率差异。
我们也对5端H1-ssNCR进行了截短,发现5端H1-ssNCR的长度也可以调节重组病毒的复制能力。重组病毒的复制效率随5端H1-ssNCR的缩短而降低。我们还对H1-ssNCR的序列要求进行了初步研究。通过人为引入随机序列和构建随机核苷酸选择库的方法发现,H1-ssNCR中AU核苷酸含量高有利于病毒的复制。H1-ssNCR的不同区域对序列的要求不同。不同位置上的核苷酸相互作用,影响病毒的复制能力。
总之,本研究揭示了H1-ssNCR对病毒复制的重要性。我们证明了启动子区域以外的非编码区序列也可以影响HAvRNA的复制,进而调节病毒的复制效率。3端H1-ssNCR与毗邻的编码区共同作用,调节HAvRNA的复制能力。H1-ssNCR的长度和序列都对病毒的复制效率有重要影响。本课题研究丰富了我们对H1-ssNCR的认识,为其他亚型的HAssNCR的研究以及非编码区RNA的研究提供了坚实基础。