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研究背景:
由动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是导致老年人和包括糖尿病在内的代谢性疾病患者死亡的主要原因。炎症是AS的主要病理改变，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是AS的危险因素，衰老则是促进动脉粥样硬化进程的直接相关危险因素。在AS炎症过程中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)被高度激活，激活的MMPs可以降解胶原蛋白、弹性蛋白和其他细胞外分子，可能导致动脉壁老化、高血压和动脉粥样硬化。然而，血小板释放MMPs的机制尚不清楚。白藜芦醇是一种天然多酚产物，具有抗炎、抗氧化和抑制血小板功能等作用，而其具体的抗AS的分子机制仍有待进一步深入研究。
目的:
1、探讨白藜芦醇对ox-LDL激活的血小板Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)以及MMP3和MMP9的影响及其潜在的分子机制。
2、探讨白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板络氨酸激酶Syk以及炎症小体NLRP3活化的影响。
3、探讨白藜芦醇对高脂喂养增龄小鼠血浆MMP3和MMP9含量的变化及主动脉TLR4、MMP3、MMP9表达和血管结构变化的影响，为白藜芦醇改善增龄、高脂饮食这两个危险因素促进AS进展相关的防治研究以及临床应用提供理论依据。
研究方法:
1、血小板分离和处理:健康人静脉血洗涤纯化获得血小板，分别孵育白藜芦醇(1μM、10μM和100μM)，TLR4抑制剂CLI-095(0.1μM、0.3μM和1μM)，Syk抑制剂R788(10nM、30nM、100nM)，NLRP3抑制剂MCC950(1nM、10nM、100nM)10分钟，之后加入0.1mg/mlox-LDL或5μg/mlLPS刺激10分钟。
2、动物模型建立:8周龄和52周龄的雄性C57BL/6J分为三组进行实验，对照组进食普通饲料，每天灌胃生理盐水一次;高脂组小鼠进食含有21％的脂肪和1.25％的胆固醇的高脂饮食，每天灌胃生理盐水一次;高脂加白藜芦醇组小鼠进食含有21％的脂肪和1.25％的胆固醇的高脂饮食，每天灌胃一次白藜芦醇(22.4 mg/kg)(分散于生理盐水中)，各组处理时间均为12周。
3、Westernblot方法:检测TLR4、MMP3和MMP9、脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)磷酸化、核苷酸结合域富含亮氨酸重复蛋白3(nucleotide-binding domain leucine rich repeat containing protein 3，NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,caspase-1)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、p53和p21的蛋白表达。
4、免疫荧光法:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板活化时形态改变和caspase-1在细胞内表达和分布。
5、流式细胞仪:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导血小板TLR4的表达。
6、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELI SA):检测MMP3、MMP9和IL-1β血小板分泌和小鼠血浆含量。
7、生化学方法;检测小鼠血脂四项，低密度脂蛋白-胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)采用全自动生化分析仪检测。
8、免疫组化染色:检测主动脉血管组织MMP3和MMP9的表达。
9、衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)染色:检测主动脉血管组织衰老细胞。
10、天狼星红染色:检测血管胶原成份。
结果:
1、白藜芦醇(100μM)抑制了ox-LDL活化的血小板中TLR4的表达，减少了OX-LDL刺激血小板在纤维蛋白原上的粘附和伪足伸出
Westernblot和流式细胞术分析TLR4表达结果显示，白藜芦醇预处理抑制了OX-LDL刺激血小板增加的TLR4表达。免疫荧光显示ox-LDL处理使血小板粘附呈现为伪足伸出以及血小板铺展。而白藜芦醇预处理使血小板恢复接近正常水平。
2、白藜芦醇抑制MMP3和MMP9表达与阻止TLR4活化相关
白藜芦醇(100μM)抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3和MMP9的表达和分泌;TLR4抑制剂CLI-095(1μM)抑制了由ox-LDL或TLR4特异性激活剂LPS刺激的血小板MMP3和MMP9表达和分泌;较低浓度的白藜芦醇和CLI-095协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3和MMP9的表达。
3、白藜芦醇通过抑制Syk/NLRP3活化减少MMP3/MMP9的表达和分泌
白藜芦醇处理抑制了ox-LDL和LPS刺激的Syk磷酸化和NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。Syk抑制剂R788抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。较低浓度的白藜芦醇和R788协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。NLRP3抑制剂MCC950也同样抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达，较低浓度的白藜芦醇和MCC950协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达。这表明Syk和NLRP3分子之间存在相互作用。免疫共沉淀结果发现，ox-LDL刺激血小板活化时二者呈结合状态，而白藜芦醇处理逆转了这一现象。
4、白藜芦醇对增龄高脂小鼠的血管保护作用
白藜芦醇降低了高脂饮食小鼠的血脂LDL-C、TG和TC水平，降低了血浆MMP3、MMP9和IL-1β含量。对血管炎症蛋白水平分析表明白藜芦醇干预减少了血管组织TLR4、MMP3和MMP9的表达。SA-β-Gal染色发现，与单纯高脂饮食对照组比较，白藜芦醇干预减少了52周龄高脂饮食小鼠的血管衰老细胞数量。天狼星染色表明白藜芦醇干预减少了52周龄高脂饮食小鼠的血管组织胶原成分的降解。
结论:
1、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板TLR4活化以及MMP3和MMP9表达和分泌，分子机制与抑制TLR4/Syk/NLRP3通路活化相关。
2、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板NLRP3炎症小体的活化，降低IL-1β的胞外释放。
3、白藜芦醇干预改善了高脂饮食喂养的增龄小鼠血管胶原结构紊乱，弹力纤维断裂的病变，降低了小鼠主动脉血管TLR4、MMP3和MMP9表达，减少了血管壁衰老细胞的表达数量，对增龄高脂饮食引起的血管损伤具有保护作用。
由动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是导致老年人和包括糖尿病在内的代谢性疾病患者死亡的主要原因。炎症是AS的主要病理改变，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是AS的危险因素，衰老则是促进动脉粥样硬化进程的直接相关危险因素。在AS炎症过程中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)被高度激活，激活的MMPs可以降解胶原蛋白、弹性蛋白和其他细胞外分子，可能导致动脉壁老化、高血压和动脉粥样硬化。然而，血小板释放MMPs的机制尚不清楚。白藜芦醇是一种天然多酚产物，具有抗炎、抗氧化和抑制血小板功能等作用，而其具体的抗AS的分子机制仍有待进一步深入研究。
目的:
1、探讨白藜芦醇对ox-LDL激活的血小板Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)以及MMP3和MMP9的影响及其潜在的分子机制。
2、探讨白藜芦醇对ox-LDL刺激血小板络氨酸激酶Syk以及炎症小体NLRP3活化的影响。
3、探讨白藜芦醇对高脂喂养增龄小鼠血浆MMP3和MMP9含量的变化及主动脉TLR4、MMP3、MMP9表达和血管结构变化的影响，为白藜芦醇改善增龄、高脂饮食这两个危险因素促进AS进展相关的防治研究以及临床应用提供理论依据。
研究方法:
1、血小板分离和处理:健康人静脉血洗涤纯化获得血小板，分别孵育白藜芦醇(1μM、10μM和100μM)，TLR4抑制剂CLI-095(0.1μM、0.3μM和1μM)，Syk抑制剂R788(10nM、30nM、100nM)，NLRP3抑制剂MCC950(1nM、10nM、100nM)10分钟，之后加入0.1mg/mlox-LDL或5μg/mlLPS刺激10分钟。
2、动物模型建立:8周龄和52周龄的雄性C57BL/6J分为三组进行实验，对照组进食普通饲料，每天灌胃生理盐水一次;高脂组小鼠进食含有21％的脂肪和1.25％的胆固醇的高脂饮食，每天灌胃生理盐水一次;高脂加白藜芦醇组小鼠进食含有21％的脂肪和1.25％的胆固醇的高脂饮食，每天灌胃一次白藜芦醇(22.4 mg/kg)(分散于生理盐水中)，各组处理时间均为12周。
3、Westernblot方法:检测TLR4、MMP3和MMP9、脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)磷酸化、核苷酸结合域富含亮氨酸重复蛋白3(nucleotide-binding domain leucine rich repeat containing protein 3，NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine-requiring Aspartate Protease-1,caspase-1)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、p53和p21的蛋白表达。
4、免疫荧光法:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导的血小板活化时形态改变和caspase-1在细胞内表达和分布。
5、流式细胞仪:检测白藜芦醇对ox-LDL诱导血小板TLR4的表达。
6、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELI SA):检测MMP3、MMP9和IL-1β血小板分泌和小鼠血浆含量。
7、生化学方法;检测小鼠血脂四项，低密度脂蛋白-胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)采用全自动生化分析仪检测。
8、免疫组化染色:检测主动脉血管组织MMP3和MMP9的表达。
9、衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)染色:检测主动脉血管组织衰老细胞。
10、天狼星红染色:检测血管胶原成份。
结果:
1、白藜芦醇(100μM)抑制了ox-LDL活化的血小板中TLR4的表达，减少了OX-LDL刺激血小板在纤维蛋白原上的粘附和伪足伸出
Westernblot和流式细胞术分析TLR4表达结果显示，白藜芦醇预处理抑制了OX-LDL刺激血小板增加的TLR4表达。免疫荧光显示ox-LDL处理使血小板粘附呈现为伪足伸出以及血小板铺展。而白藜芦醇预处理使血小板恢复接近正常水平。
2、白藜芦醇抑制MMP3和MMP9表达与阻止TLR4活化相关
白藜芦醇(100μM)抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3和MMP9的表达和分泌;TLR4抑制剂CLI-095(1μM)抑制了由ox-LDL或TLR4特异性激活剂LPS刺激的血小板MMP3和MMP9表达和分泌;较低浓度的白藜芦醇和CLI-095协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3和MMP9的表达。
3、白藜芦醇通过抑制Syk/NLRP3活化减少MMP3/MMP9的表达和分泌
白藜芦醇处理抑制了ox-LDL和LPS刺激的Syk磷酸化和NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。Syk抑制剂R788抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。较低浓度的白藜芦醇和R788协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3、MMP9、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达。NLRP3抑制剂MCC950也同样抑制了ox-LDL刺激的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达，较低浓度的白藜芦醇和MCC950协同抑制ox-LDL和LPS激活的血小板中MMP3、MMP9、Caspase-1和IL-1β的表达。这表明Syk和NLRP3分子之间存在相互作用。免疫共沉淀结果发现，ox-LDL刺激血小板活化时二者呈结合状态，而白藜芦醇处理逆转了这一现象。
4、白藜芦醇对增龄高脂小鼠的血管保护作用
白藜芦醇降低了高脂饮食小鼠的血脂LDL-C、TG和TC水平，降低了血浆MMP3、MMP9和IL-1β含量。对血管炎症蛋白水平分析表明白藜芦醇干预减少了血管组织TLR4、MMP3和MMP9的表达。SA-β-Gal染色发现，与单纯高脂饮食对照组比较，白藜芦醇干预减少了52周龄高脂饮食小鼠的血管衰老细胞数量。天狼星染色表明白藜芦醇干预减少了52周龄高脂饮食小鼠的血管组织胶原成分的降解。
结论:
1、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板TLR4活化以及MMP3和MMP9表达和分泌，分子机制与抑制TLR4/Syk/NLRP3通路活化相关。
2、白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激血小板NLRP3炎症小体的活化，降低IL-1β的胞外释放。
3、白藜芦醇干预改善了高脂饮食喂养的增龄小鼠血管胶原结构紊乱，弹力纤维断裂的病变，降低了小鼠主动脉血管TLR4、MMP3和MMP9表达，减少了血管壁衰老细胞的表达数量，对增龄高脂饮食引起的血管损伤具有保护作用。