论文部分内容阅读
低能离子注入技术作为生物物理诱变的一种新型技术,在园艺植物育种方面具有很大的应用潜力。目前,离子注入技术已经运用在了白洋淀红莲新品种选育中,经过对离子注入后莲花新品种筛选试验,发现离子注入使莲花在花型、花色、花期等方面发生了变化,这一变化极大地提高了作为中国传统名花和重要经济植物莲花的利用价值。然而,从分子水平上对离子注入诱变莲花突变体进行鉴定还是空白,有关离子注入诱变分子机理的研究报道还甚少。鉴于此,本研究以白洋淀红莲及其经Fe+离子注入诱变的突变体为材料,利用同工酶、RAPD标记、SRAP标记分别对突变体及其对照之间的差异进行了比较研究,期望为离子注入诱变莲花突变体的鉴定提供分子水平上的依据,并为进一步揭示低能离子注入诱变作用分子机理奠定基础。主要研究结果如下:1、利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对经离子注入诱变的白洋淀红莲突变体及其对照的过氧化物同工酶(POD)和超氧化物歧化酶同工酶(SOD)进行分析。结果表明,离子注入诱变引起了白洋淀红莲的POD和SOD的变化,且经过离子注入诱变后的白洋淀红莲不同突变体间的POD和SOD存在显著差异。2、对离子注入诱变的白洋淀红莲突变体及其对照的基因组进行RAPD研究,并将突变体和对照在辐射敏感位点的条带进行克隆测序及DNA序列分析。在优化好的RAPD体系下扩增,从110条随机引物中筛选出了10条可以稳定扩增出显著特异条带的引物,引物多态性为9.09%。将这10条引物扩增出的辐射敏感位点的条带进行克隆测序,并进行序列比对。结果显示:突变体的总碱基突变频率为0.87%,6个突变体的碱基突变频率存在着差异;碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入,在检测到的159个碱基突变中,单碱基置换的频率(61.01%)高于碱基插入或者缺失的频率(38.99%),在碱基置换中,转换的频率(44.65%)是颠换频率(16.35%)的2.7倍,其中C/T之间的转换所占比例最大,A→G和A→T也具有较高的替换频率;构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异,除了没有C→G的置换外,每一种碱基都可以被其他的几种碱基所置换,但是胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)具有相对较高的辐射敏感性。通过对碱基突变位点周边序列的分析发现,嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多,嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。3、对离子注入诱变的白洋淀红莲突变体及其对照的基因组进行SRAP扩增,在优化好的SRAP体系基础上,从121对引物组合中筛选出了10对可以稳定扩增出显著特异条带的引物,引物多态性为8.26%;将这10对引物的扩增产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,共扩增出了215条带,多态性条带为83条,多态率为38.6%;不同的突变体条带变异率不同;将其中的7对引物组合的扩增产物用琼脂糖电泳检测,将其扩增出的辐射敏感条带进行克隆测序及DNA序列分析,结果表明:突变体的总碱基突变频率为0.95%,不同突变体的碱基变异率不相同;碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入,其中单碱基置换的频率(58.22%)高于碱基插入和缺失的频率(41.78%)。在碱基置换中,转换的频率(45.21%)是颠换频率(13.01%)的约3.5倍。构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异,腺嘌呤(A)发生变异60次(包括31次缺失和5次插入突变),鸟嘌呤(G)发生变异39次(包括15次缺失突变),胞嘧啶(C)发生变异27次(包括6次缺失和4次插入突变),胸腺嘧啶(T)发生变异19次(未检测出缺失或插入突变),相对而言,腺嘌呤(A)具有更高的辐射敏感性。分析碱基突变位点的周边序列发现,嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多,嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。