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别孕烯醇酮（allopregnanolone，APα）是孕酮在酶的作用下转化生成的衍生物，产生于中枢或周围神经系统中，特别是胚胎或成年动物的中枢神经系统及多潜能祖细胞中。研究表明，APα在生理浓度下通过激活结合γ-氧基丁酸A受体(GABAA receptor, GABAAR)依赖L-型钙离子通道，促进啮齿类动物和人的神经祖细胞的增生。在神经退行性疾病中，阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是老年痴呆最常见的类型，主要病理变化为β淀粉样斑块(amyloid-beta，Aβ)沉积形成的老年斑，tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结和神经细胞的大量死亡。除认知功能退化外，35～40％的AD患者还具有锥体外系运动症状或帕金森氏病征，运动功能损害主要归因于黑质（Substantia nigra，SN）一纹状体体系的生化和结构改变。在AD或AD伴有帕金森氏病征患者的黑质-纹状体通路内，可发现神经原纤维缠结、Aβ斑块、路易小体(Lewy bodies，LB)的存在以及多巴胺能神经元的丢失和多巴胺(DA)含量的下降，表明Aβ等的病理变化在多巴胺能神经元功能缺失中起着重要作用，同时也表明AD是黑质(substantia nigra，SN)损伤的一个重要危险因素。AD转基因动物模型APP/PS1(2xTgAD)因含突变的致病基因PS1(M146V)和APP(Swe)，能够成功模拟AD病理学和行为学的变化，是目前AD病因学机制探讨中理想模型，也是提供评估AD治疗潜力的重要模型。 本实验旨在观察APα对AD小鼠SN多巴胺能神经元是否有影响，并探讨可能的机制，分为两部分。 第一部分:首先评估APα对2xTgAD小鼠SN酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH，多巴胺能神经元的标记物)阳性神经元数目的影响。采用4月龄雄性2xTgAD和同窝野生型小鼠(wild type，WT)，并给予APα剂量为20mg/kg皮下注射一次或等体积的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）处理。采用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA; Lab-bioBiomart,北京)测定APα浓度，组织化学和免疫荧光染色结合Image J软件观察和计算各阳性细胞的数目。结果发现，4月龄2xTgAD小鼠SN内TH阳性神经元及总神经元的数目均明显减少，给予APα处理后TH阳性神经元及总神经元的数目均有所恢复，且TH/溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)双标记神经元数目也明显增加，说明有新生TH阳性神经元的形成。此外，我们研究还发现，4月龄2xTgAD小鼠各脑区未见Aβ斑块形成，但血清和大脑皮质中内源性APα水平明显减少，表明4月龄2xTgAD小鼠内源性APα水平下降出现在Aβ阳性斑块形成之前。当给予外源性APα处理2小时，可通过提升血清和大脑皮质中APα水平来增加新生多巴胺能神经元形成继而弥补多巴胺能神经元数目的缺陷。 更为重要的是，我们对室下区(subventricularzone，SVZ)和海马齿状回颗粒下层(subgranularzone，SGZ)中的神经前体细胞标记物微管相关蛋白(Doublecortin，DCX)及DCX/BrdU阳性细胞数进行分析，发现4月龄2xTgAD小鼠SVZ中总的DCX数目明显减少，在给予APα处理后总的DCX和DCX/BrdU阳性细胞数均明显增多。对SN中的新生细胞进行神经元核抗原(neuron specificnuclear protein，NeuN)和胶质细胞源性纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein，GFAP)免疫荧光染色发现，4月龄2xTgAD小鼠BrdU阳性细胞同时被NeuN标记的数目明显减少，给予APα处理新生NeuN神经元占BrdU阳性细胞的百分比明显增加，表明APα能够促进SN中新生细胞向成熟神经元的转化。上述结果表明，APα促进2xTgAD小鼠新生TH阳性神经元的形成与其诱导的SVZ神经干细胞的增殖和分化相一致，表明两者间存在关联，但具体情况尚不清楚。 有研究表明，SN中少量TH/BrdU阳性神经元是从SVZ迁移而来，而来自中脑顶盖组织、中脑水管和第四脑室室管膜的神经前体细胞最终可分化为功能性的多巴胺能神经元。在6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)毁损成年蝾螈中脑多巴胺能神经元的早期，在出现放射状胶质样室管膜细胞增殖和分化的同时，SN中新生多巴胺能神经元的形成也明显增加。这些结果提示，室管膜细胞的增殖和分化可能是SN新生多巴胺能神经元形成的根源。 第二部分:我们首先发现，与6-OHDA单侧注射小鼠SN3天后TH阳性神经元大量减少相比，6-OHDA注射35天后SN中TH阳性神经元已基本恢复，暗示原本处于静息或沉默的TH阳性前体细胞在受到6-OHDA刺激之后被激活，通过其增殖和分化来弥补6-OHDA对SN多巴胺能神经元的毁损。然后，我们观察了具有静态神经干细胞属性的CD133标记的室管膜细胞的分布情况。通过构建含CD133启动子的mP2-pCAG-cre重组质粒（简称mP2质粒），并将其注射至Rosa26-LacZ小鼠侧脑室的脑脊液及电转染至室管膜细胞中，同时向该动物的SN中再注射6-OHDA，进行X-gal染色和β-gal和TH免疫荧光染色。结果发现，静息状态下CD133阳性的室管膜细胞分布在侧脑室和中脑水管的室管膜下区(subependymalzone，SEZ)和SVZ中;在完成Rosa26-LacZ小鼠注射、转染含CD133-Cre重组质粒及SN中注射6-0HDA一天后，X-gal染色显示CD133阳性细胞离开侧脑室及第三脑室的SVZ进入周围区，且在SN中发现β-gal标记的CD133阳性细胞，尽管在6-OHDA注射一天后SN中的这些CD133阳性细胞未见与TH阳性神经元共存。此外，在B6小鼠侧脑室的SVZ和SEZ可观察到大量新生的CD133阳性室管膜细胞。这些结果表明，CD133表达的室管膜细胞在受到刺激之后是可被诱导分裂和分化的，而且通过观察CD133子代细胞与细胞标记物的共存情况，能够追踪它们的迁移和分化。因此，CD133室管膜细胞为观察新生多巴胺能神经元的起源提供理想的模型。然而，CD133阳性室管膜细胞是如何迁移至黑质并分化为多巴胺能神经元还有待于进一步观察和研究。 总之，本研究表明4月龄2xTgAD小鼠血清和大脑皮质中内源性APα水平下降出现在SN中TH阳性神经元下降之前。给予外源性APα处理能够通过促进新生的TH阳性神经元的形成来预防或延迟2xTgAD小鼠TH阳性神经元的减少。这些结果暗示这些补偿的TH阳性神经元可能来自SVZ中的神经干细胞。作为低分子量，易通过血脑屏障的新生神经元形成促进剂，APα在治疗AD或AD伴发的帕金森氏症中日益显出其重要的意义。