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线虫作为植物的重要病原物之一,为农林业生产带来了重大损失。以往人们多使用一些高毒的化学农药来防治该类病原物,这些药物对人畜不安全,对环境污染严重,易使线虫产生抗药性,对有益生物杀伤力强,不符合当代可持续农业发展的要求。鉴于此,人们将目光转向了生物防治。在线虫的生物防治方面,食线虫菌物(nematophagous fungi)具有非常重要的地位。本论文对采自海南、湖南和广东三省土样中分离到的菌株进行了生物筛选,对获得的一株根结线虫高效菌株的生物学性质、对线虫的捕捉特性、及其角质层降解丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达进行了研究。本研究主要取得了以下结果:
1.经过对105株捕食线虫真菌生长速率、对Panagrellus redivivus线虫的捕捉效率及产生捕捉器的情况的比较,初步筛选了19株捕食线虫真菌,用初筛菌株对爪哇根结线虫进行皿内生测,进一步选出8株捕食线虫真菌,用这8株真菌对爪哇根结线虫二龄幼虫捕捉率随时间变化及对番茄根结线虫病(Meloidogyne javanica)的防效进行了试验,最终筛选出一株高效菌株lg21-1,盆栽试验显示该菌株对番茄根结线虫病的防效达52.63%。
2.应用形态学和分子生物学技术鉴定了菌株lg21-1为一新种,定名为海南隔指孢(Dactylella hainanens Y.Z.Li&J.L.Liao,n.sp.)。该菌形态特征为分生孢子棒状,远轴端钝圆,长17.7~40.5(27.7)μm,宽4.8~10.1(7.0) μm,有0~4个隔,大多数1~3个分隔;分生孢子多为孢子梗项部单端生,少多生,最多不超过4个,老熟菌丝易生厚垣孢子,厚垣孢子近圆形,直径大小一般在7.5~12.5(11.3) μm。菌株的捕食器官为黏性球,多数黏性球的柄垂直伸出菌丝生长。应用了rDNA-ITS区和RNA聚合酶II基因的部分区域对菌株进行鉴定,同源比对结果显示,该菌与虫生节丛孢(Arthrobotrys entomopaga)的同源性最高,但两者形态明显不同;同时,结果还显示,以捕捉器类型对捕食线虫真菌进行归类更合理,与分子进化更为一致。
3.海南隔指孢生物学性质的研究结果显示,该菌在15~30℃的情况下均可生长,最适生长温度在25℃左右;在pH值5~9之间均可生长,较适宜的pH值范围在5~8之间,生长最适pH值为5,光照可以促进菌株的生长;在碳源利用上,葡萄糖、麦芽糖和D-果糖是海南隔指孢较为合适的碳源;在氮源的利用上,酵母浸出粉、胰蛋白胨和水解酪蛋白是较为合适的氮源;从碳氮源的利用比率来看,碳氮比在10:1,是较为合适的比例。从产孢量多少的角度考虑,海南隔指孢的最适pH值为6,最适碳源为麦芽糖,最适氮源为酵母浸出粉,最适碳氮比为10:1,光照条件要求暗培养。
4.对海南隔指孢的进一步研究显示,菌株菌落的幼嫩菌丝对线虫的捕捉效果明显较老菌丝强,生长不同天数的菌落对线虫的捕捉能力明显不同:对不同种类线虫的捕捉率也表现出一定差异;其孢子在水中产生很短的芽管后即可产生较多的黏性球,进行线虫的侵染;该菌对番茄上南方根结线虫病的防效可达58.9%,并且可随着施菌量的增加而增加,且对番茄的生长无负作用。
5.使用兼并引物和RACE技术从海南隔指孢中获得了两个丝氨酸蛋白酶基因,分别被命名为DhCSP和DhSLP。其中,DhCSP包含1270bp的ORF框,编码含有405个氨基酸残基的蛋白质,并且在其ORF框内含有一个52bp的内含子;DhSLP包含1843bp的ORF框,编码含有506个氨基酸残基的蛋白质,并且在其ORF框内含有263bp和59bp的两个内含子。经过对基因编码氨基酸序列的详细分析、比对和构建系统发育树等一系列研究表明,DhCSP与囊孢单顶孢(Monacrosporium cystosporium)角质层降解丝氨酸蛋白酶基因同源达68.3%,DhSLP是一个类枯草杆菌蛋白酶基因。应用半定量RT-PCR技术对克隆出的基因DhCSP和DhSLP进行表达研究,结果显示,两个基因的表达随时间而变化,且均在加虫后48hr时出现表达最高峰。