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本研究以被解除了异亮氨酸阻遏作用产L-异亮氨酸大肠杆菌N12为出发菌株,运用诱变育种和代谢工程两种手段,对其进行改造,并优化其发酵条件,以望获得具有工业化生产价值的高产菌株。主要内容及研究结果如下:1、产L-异亮氨酸大肠杆菌N12的诱变。以解除了异亮氨酸阻遏作用产L-异亮氨酸大肠杆菌N12为出发菌株,经硫酸二乙酯(Diethyl sulfate,DES)多次诱变,通过摇瓶初筛和摇瓶复筛,选育得到一株L-异亮氨酸产生菌大肠杆菌NML(Met-+Leu-),摇瓶发酵48h,L-异亮氨酸积累量达到2.77g/L,比出发菌株N12提高了 233.73%;继续诱变筛选,获得一株遗传性状稳定的L-异亮氨酸高产菌株大肠杆菌NMLL(Met-+Leu-+Lys-,在未经优化的条件下发酵48h,L-异亮氨酸产量达到3.29g/L,较N12提高了 296.39%,较突变菌株NML提高了 18.8%。采甩2,4-二硝基氯苯柱前衍生法,通过高效液相色谱系统对发酵液中L-异亮氨酸进行了定量分析的研究,确立了 L-异亮氨酸定量测定的最优方法和条件为:50%乙腈与NaAc溶液3:2洗脱,柱温30℃,流动相流量lmL/min,检测波长360nm。2、大肠杆菌NMLL发酵条件优化的研究。通过单因素和Design Expert软件的Box-BehnkenDesign(BBD)对突变菌株NMLL在1000mL摇瓶中的发酵条件进行了优化,并获得该菌株的最佳发酵培养条件为:葡萄糖116.40g/L、硫酸铵40g/L、玉米浆12.03mL/L、磷酸二氢钾 0.05g/L,MgSO4·7H20 2.5g/L,FeSO4-7H20.01g/L,碳酸钙 2.0g/L。在优化条件下,菌株NMLL摇瓶分批发酵48h,可产L-异亮氨酸4.62g/L,较优化前提高40.43%。3、重组大肠杆菌N12-lysC的构建及其对L-异亮氨酸发酵产酸的影响。天冬氨酸激酶足L-异亮氨酸合成途径中的关键酶,由lysC基因编码。以荧光假单胞菌F113(Pseudomonas fluorescens)的基因组为模板,扩增得到IysC基因,将其连接到质粒pSTV28上,获得重组质粒pSTV28-lysC,转化至大肠杆菌N12中,得到重组菌株N12-lysC。在500mL摇瓶中使用基础培养基进行L-异亮氨酸发酵,分析其发酵性能。结果表明,在36℃、pH7.0、180rpm条件下发酵48h,发酵液中L-异亮氨酸浓度达到1.35g/L,与对照菌株大肠杆菌Nl2相比,提高了 62.65%,表明过量表达异源天冬氨酸激酶对L-异亮氨酸发酵有积极作用,可有效提高L-异亮氨酸的积累浓度。由上述研究表明,通过诱变育种与代谢工程两种手段均能提高L-异亮氨酸产量,虽然重组菌较诱变菌在产酸上稍有劣势,但其稳定性较好,需进一步优化发酵条件,提高产酸率。