论文部分内容阅读
随着工业的发展，环境中的镉通过消化道和呼吸道进入生物体内引起镉的慢性蓄积。骨骼是镉毒性作用的重要靶器官，长期低剂量的镉暴露引起骨密度下降，抑制骨矿化。研究表明，镉能增加成骨细胞RANKL的表达，同时抑制骨保护素(OPG)的表达，进而促进破骨细胞(OC)的分化，同时镉也能促进破骨细胞前体RAW264.7细胞向OC分化，但镉调控OC分化的分子机制尚不清楚。钙离子是细胞中重要的生理调节因子，可以调控细胞的增殖、分化和凋亡等。本文以5-6周龄C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞诱导形成OC，研究不同浓度镉处理对OC分化的影响，以及钙离子和CaM/CaMKs信号在镉影响OC分化的作用机制。 1.镉对OC分化的影响 采集5-6周龄C57BL/6雄性小鼠骨髓巨噬细胞，以0、20、50、100nM的镉加入含有30ng/ml M-CSF和60ng/ml RANKL的α-MEM培养基，培养5d后，TRAP染色鉴定OC的形成数量，Western blot检测OC中NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK蛋白表达水平，RT-qPCR检测OC相关基因NFATc1、TRAP、c-Fos、CAⅡ的表达变化。结果显示，随着镉浓度的升高，OC的形成数量增加;50、100nM镉处理使OC的NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK蛋白表达水平呈显著或极显著上升，但对NFATc1的基因表达水平没有显著影响。表明，低浓度的镉(50、100nM)能促进OC的分化。 2.钙离子信号在镉影响OC分化中的作用 为了揭示钙离子信号在镉影响OC分化过程中的作用，在骨髓巨噬细胞培养的不同时间采用钙离子螯合剂BAPTA-AM与镉共处理，并用2-APB（IP3受体抑制剂）和TG(STIM1钙离子通道抑制剂)与镉共处理，Western blot检测OC中骨吸收相关蛋白NFATc1、TRAP、CAⅡ、CK的表达，激光共聚焦显微镜观察胞内钙离子振荡，TRAP染色鉴定OC的形成数量。结果显示，随着镉浓度的增加(0、20、50、100nM)，钙离子振荡随之增强，且BAPTA-AM能显著降低镉对OC钙离子振荡的增强作用;镉与BAPTA-AM共处理可以显著抑制OC骨吸收相关蛋白的表达;2-APB、TG与镉共处理也能显著抑制镉对OC钙离子振荡的增强作用，降低OC骨吸收相关蛋白的表达。表明在破骨细胞分化过程中，镉激活内质网释放钙离子到胞浆，增加胞浆内钙离子的浓度，引起胞浆内钙离子振荡，进一步激活NFATc1及其下游蛋白的表达，最终促进OC分化。 3.Ca2+/CaM/CaMKs信号通路在镉影响OC分化中的作用 为了研究Ca2+/CaM/CaMKs信号通路在镉影响OC分化过程中的作用，用KN-93（CaMKⅡ抑制剂）、W-7（CaM抑制剂）和STO-609（CAMKK抑制剂）与镉共处理细胞，检测P-CaM、P-CaMKⅡ、P-CaMKⅣ表达水平的变化。结果显示，KN-93、W-7、STO-609与镉共处理，OC阳性细胞数显著下降，与镉处理组相比，镉与KN-93、W-7及STO-609组显著抑制了钙离子通道相关标志蛋白P-CaM、P-CaMKⅡ、P-CaMKⅣ表达水平。NFATc1作为Ca2+/CaM/CaMKs的下游分子也是OC分化的重要转录因子，在镉与不同钙离子通道的抑制剂共处理情况下，NFATc1在核内的表达水平同时受到一定的抑制。由此可见，镉能够激活Ca2+/CaM/CaMKs信号通路，同时，CaM可以直接激活CaMKⅤ/CaMKⅡ，增加NFATc1的表达而促进OC分化。