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全氟烷酸类化合物(PFASs)是一类新型持久性有机污染物(POPs),广泛应用于工业生产和民用产品中。其大量生产和排放造成了PFASs在全球环境介质中的广泛检出。目前,越来越多的研究表明长链PFASs在生物体内积累并产生毒性效应,且随着碳链长度的增加毒性也增强。本文重点关注PFASs的肝脏毒性,以大鼠原代肝细胞为模型,一方面,研究全氟辛酸(PFOA)对肝脏的毒性效应;另一方面,通过构建慢病毒兼容的过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) RNA干扰(RNAi)载体,包装慢病毒,研究全氟十二碳羧酸(PFDoA)致大鼠的肝脏毒性效应,探讨PPARα在PFDoA致大鼠肝脏毒性机制中的作用及其在肝脏细胞氧化损伤中所扮演的角色。取得主要结果如下: (1)通过不同浓度PFOA暴露大鼠原代肝细胞,发现PFOA暴露24 h能够刺激肝细胞内活性氧(ROS)的增加,并且能够显著降低肝细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCHO)的含量。发现Ppara及其下游基因Cte1、Mte1、Cyp4a1、Ech1和Hadha的表达量显著升高,其中Cte1上升倍数最高。高浓度、短时间暴露和低浓度、长时间暴露实验结果都显示Cte1基因的变化最敏感。RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)和免疫荧光细胞化学(ICC)实验进一步证实PFOA暴露后激活Ppara,其下游基因Cte1在mRNA水平和蛋白水平均显著升高。该部分结果表明,PFOA能够刺激肝细胞内ROS的增加,激活大鼠肝脏PPARα及其下游基因,干扰脂代谢。 (2)为研究PPARα在PFDoA诱导肝细胞氧化损伤中的作用,用PPARα抑制剂(GW6471)和激动剂(WY14643)分别处理原代肝细胞后,再进行PFDoA暴露。与对照组相比,PFDoA处理组和GW6471处理组细胞内ROS含量均显著升高;GW6471处理后再用PFDoA处理,细胞内ROS含量显著高于单独用PFDoA处理。Cte1,Mte1和Cyp4a1的mRNA水平在PFDoA处理组中较对照组显著上升,而在GW6471处理组中显著下降;同时,经GW6471处理后再用PFDoA处理,Cte1和Mte1基因mRNA水平低于单独用PFDoA处理组。与对照组相比,WY14643处理组细胞内ROS含量显著下降,而PFDoA处理组ROS含量显著上升;WY14643处理后再用PFDoA处理,细胞内ROS含量显著低于单独用PFDoA处理。Cte1,Mte1和Cyp4a1的mRNA水平在PFDoA处理组和WY14643处理组中均较对照组显著上升,WY14643处理后再用PFDoA处理,上述三个基因显著高于单独用PFDoA处理。 (3)为进一步研究PPARα在PFDoA诱导肝脏毒性中的作用,建立了慢病毒介导的大鼠原代肝细胞PPARα RNA干扰的方法。通过构建PPARα RNA干扰载体,与PPARα过表达载体共转染HEK293细胞,筛选出最佳RNA干扰序列后,再通过重组克隆技术将PPARα干扰序列转到慢病毒兼容的载体上(Lenti-miPparα)。与辅助质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞进行慢病毒包装,得到滴度大于108 TU/ml的慢病毒液后用于下游PPARα的RNA干扰实验。 (4)通过Lenti-miPparα慢病毒侵染大鼠原代肝细胞,成功实现了大鼠原代肝细胞PPARα在mRNA水平的干扰(干扰效率在70%以上)及蛋白质水平的敲降。发现PPARα敲降后,CTE1和MTE1的蛋白水平比未敲降组中显著下降;PFDoA暴露后,敲降组与未敲降组相比,CTE1和MTE1的蛋白水平也显著下降。说明在PFDoA致大鼠肝脏毒性机制中,PPARα正向调控CTE1和MTE1蛋白的表达,而其它蛋白(HADHA,ECH1,ALDH2和CPS1)未表现出严格的调控方式。PFDoA暴露会导致胞内ROS含量显著增加,仅敲降PPARα后,胞内ROS含量与未敲降组相比显著增加;敲降PPARα后再暴露PFDoA与未敲降PPARα只暴露PFDoA相比,ROS含量显著增加。仅敲降PPARα后,抗氧化相关基因Sod2 mRNA水平与未敲降组相比显著增加;敲降PPARα后再暴露PFDoA与未敲降PPARα只暴露PFDoA相比,Sod2 mRNA水平仍显著增加;ROS清除相关基因Cat的mRNA水平则与之相反。 结果表明,PPARα在PFDoA致大鼠肝脏毒性效应中可抑制ROS的累积,对肝脏细胞起到保护作用,PPARα的激活减轻了PFDoA暴露对肝脏细胞所产生的氧化损伤。