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转移是恶性肿瘤生物学行为的本质特征,也是临床肿瘤疾病分级、判断恶性程度的重要标准,因此研究肿瘤转移是防治肿瘤的一项重要任务。传统中医理论根据恶性肿瘤的机理将其治疗原则总结为四点：扶正培本、清热解毒、活血化瘀、化痰祛湿。其中活血化瘀法最近几年的研究较多,大量的基础实验和临床研究表明大部分肿瘤患者存在血瘀证,这从患者的临床表现、血液流变学异常、微循环障碍及血液的高凝状态得到证实。血瘀证不仅是恶性肿瘤患者客观存在的病理状态,同时可能是癌细胞转移的有利因素,并贯穿于肿瘤的发生、增殖、浸润和转移不同的病理阶段。其中肿瘤的恶性程度愈高,病期愈晚者,其高凝现象也愈明显。所以活血化瘀药在肿瘤的治疗过程中广泛应用。但是一些临床及基础实验的研究结果与此却大相径庭,以为某些活血药可能有促进肿瘤转移的作用,而也有一部分研究称活血药可以抑制肿瘤的增殖及转移,那么活血化瘀药在肿瘤治疗过程中究竟是促进还是抑制,可能活血药与其他方法如益气法、行气法等配伍方法不同有关,也可能与现代医学的干预如手术、放化疗和中药应用的先后次序不同有关,也可能与药物本身的作用特点及实验方法有关,总之至今很难得出客观准确的结论,所以进一步地研究活血化瘀药治疗恶性肿瘤的合理性势在必行。本课题是在导师前期工作的基础上依托国家自然科学基金展开的。前期通过体内实验观察了丹参、鸡血藤、水蛭、川芎、苏木对肺癌微转移的影响,结果显示苏木对肿瘤转移具有较明显的抑制作用。因此我们选择了苏木总提取液干预PG细胞,并将其接种于裸鼠,使其发生自发转移,通过检测原位瘤的瘤重及抑瘤率、原位瘤E-cad的表达、肺CD44v6表达、肝VEGF等的表达,体外实验采用MTT实验、流式细胞术检测CD29、重建基底膜侵袭等实验,从不同角度说明苏木对PG细胞增殖、粘附、侵袭及转移能力的影响进而分析苏木抑制肿瘤的机制,为临床医生对恶性肿瘤患者能否使用活血化瘀药物提供科学依据。研究方法体内实验：于常氧(5%C02、95%空气)和低氧(5%O2、5%CO2、90%N2)环境下培养PG细胞,用不同浓度的苏木总提取液给予干预,同时设立空白对照组、对照DDP组。各组细胞经药物干预后接种于裸鼠右腋下,第28d处死动物,取材肺、肝、瘤并分别采用免疫组化的方法检测CD44v6、VEGF、E-cad的表达。体外实验：建立常氧和低氧人巨细胞肺癌细胞生长、粘附、侵袭模型,以不同浓度的苏木总提取液进行干预,同时设空白对照和顺铂对照。利用MTT法检测其对PG细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测其对PG细胞CD29表达的影响,利用浸润小室(transwell)模型研究其对PG细胞粘附和侵袭的影响。研究结果1MTT检测增殖情况：常氧24h时,实验组和顺铂组与阴性正常组比较均无明显差异(P>0.05)；低氧24h时顺铂组与阴性正常组比较有差异(P<0.05),实验组与阴性对照组比较都有不同程度的抑制,但无统计学意义(P>0.05)。说明24h时两种氧环境下,苏木对PG细胞的增殖无明显影响。常氧48h时实验组与阴性正常组比较均有明显抑制作用(P<0.05),顺铂组与各实验组也均有差异(P<0.05)；低氧48h时除了200μg/m1、100μg/ml组外,其余实验组与阴性正常组比较抑制作用显著,有统计学意义(P<0.05)。说明低氧与常氧相比,对PG细胞的增殖影响不明显,并且在48h时苏木才对PG细胞的增殖有明显的抑制作用。2流式细胞术检测CD29的表达：常氧组CD29表达的平均荧光强度低于低氧组,但没有统计学意义(P>0.05)。在常氧和低氧环境中,各实验组与对照组,各实验组之间PG细胞CD29平均荧光强度均有差异(P<0.05),苏木提取液中浓度和顺铂对PG细胞CD29的表达没有差异(P>0.05)。说明苏木能够明显降低PG细胞表面CD29的表达,其中高浓度的苏木抑制作用明显优于顺铂组。3原位瘤瘤重及抑瘤率：常氧中苏木组瘤重明显低于对照组,有统计学上差异(P<0.001)；常氧苏木组与DDP组相比也有差异(P<0.001),其中苏木组抑瘤率为21.20%,DDP组抑瘤率为83.80%,苏木组不及DDP组。低氧中苏木组和对照组、DDP组相比也均有差异(P<0.001),其中苏木抑瘤率57.30%,DDP组抑瘤率90.30%。常氧和低氧环境相比,苏木组之间、DDP组之间均没差异(P>0.05),对照组之间有差异(P<0.001)。说明低氧环境下肿瘤细胞增殖更快,苏木在低氧环境下抑瘤率更明显,但均不及顺铂抑瘤效果。4肺组织CD44v6表达情况：苏木组及顺铂组表达的CD44v6在低氧环境下低于常氧环境,明显有差异,均有统计学意义(P<0.05)。苏木组在常氧环境下表达高于顺铂组,但没统计学意义(P>0.05).苏木组在低氧环境下表达明显低于顺铂组,有统计学意义(P<0.001),苏木组和顺铂组两种环境下与对照组均有明显差异(P<0.001)。说明苏木组和顺铂组在CD44v6表达方面作用均有明显抑制作用,其中低氧环境下苏木组比顺铂组抑制作用更强。5肝组织VEGF表达情况：阴性对照组表达的VEGF在低氧环境下明显高于常氧环境,有统计学意义(P<0.05)；苏木组表达的VEGF在常氧环境下明显高于低氧环境,统计学上有差异(P<0.05)；顺铂组表达的VEGF在低氧环境下高于常氧环境,但无统计学差异(P>0.05)。苏木组和顺铂组常氧环境下表达均高于对照组,均有差异(P<0.001)低氧环境下苏木组有抑制血管生成的作用,但无明显差异(P>0.05)。说明苏木组和顺铂组常氧环境下均有明显促进血管生成作用,低氧环境下苏木则无明显作用。6原位瘤E-cad表达情况：苏木组、顺铂组E-cad表达上常氧环境下均高于阴性对照,低氧环境下均低于阴性对照组,但在两种环境下均无统计学意义(P>0.05)。说明苏木和顺铂组对E-cad的表达均无明显影响。7侵袭实验：低浓度组和正常对照组在低氧环境中累积光密度值高于常氧环境,中浓度组、高浓度组及顺铂组在常氧环境下累积光密度值高于低氧环境,但两种氧环境比较无明显差异(P>0.05)。在常氧和低氧微环境中,高、中、低浓度的苏木组及顺铂组的累积光密度值均有明显下降,下降的趋势呈剂量依赖性,其中顺铂组累积光密度值低于中浓度组,但无统计学意义(P>0.05)。各实验组累积光密度值与正常对照组比较均有统计学意义,各实验组之间累积光密度值的差异除了中浓度与顺铂组无差异外,其余均有统计学意义(P<0.001)。说明苏木在常氧、低氧环境下均可以明显的抑制PG细胞的侵袭,其中高浓度组时抑制率高于顺铂,证明苏木在抑制肿瘤侵袭方面是有效的。综合上述结果,我们认为苏木提取物有明显的抑制肿瘤的作用,包括抑制肿瘤的增殖、粘附和侵袭等过程。其中增殖阶段在两种氧环境下苏木均有明显抑瘤作用,其中低氧环境下抑瘤率更高；粘附阶段主要是可以降低癌细胞表面整合素的表达,即降低癌细胞与基膜的粘附过程,而对钙依赖粘附素的表达,即细胞之间的粘附没有明显的影响；侵袭阶段发现随着苏木浓度的增高肿瘤抑制作用也明显增高,成剂量依赖性；在血管生成方面苏木能够促进血管的生成,其中常氧环境下尤其明显。