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鹅不食草Centipeda minima(L.)A.Br.et.Ascher.系菊科(Compositae)石胡荽属植物,全属只有一种植物,为常用中药。鹅不食草主要功能为通鼻窍,止咳喘:用于风寒头痛、咳嗽多痰、鼻塞不通、鼻渊流涕、疟疾、风湿等症。最近研究发现,鹅不食草具有抗肿瘤活性。本课题采用生物追踪法,首先对鹅不食草的抗肿瘤活性组分进行了筛选。结果显示,在石油醚组分和乙酸乙酯组分有显著的抗肿瘤活性。在该结果指导下,由合作实验室对石油醚组分和乙酸乙酯组分进行进一步的分离提取并获得20个单体化合物。通过对这些化合物进行体外的抗肿瘤活性筛选。结果发现,蒲公英甾醇(Taraxasterol)、短叶老鹳草素(Brevilin)、二氢堆心菊灵(13-dihydrohelenalin)具有比较高的细胞毒性。13-dihydrohelenalin和Taraxasterol均有抗肿瘤的相关报道,因此,确定短叶老鹳草素为本研究的化合物。
化疗药物应具有选择毒性。本研究利用七株肿瘤细胞和两株正常细胞对Brevilin的细胞毒性和抗增殖活性进行了分析,结果显示,MKN45和HL60细胞具有较高的敏感性,并且Brevilin对正常细胞株毒性普遍小于肿瘤细胞。在体内的抗肿瘤结果显示,Brevilin能够显著抑制肿瘤的生长。虽然抗增殖活性小于相同剂量的环磷酰氨,但是Brevilin对体重的影响更小。这为Brevilin的进一步研究提供了重要的科学依据。
不同的抗肿瘤药物拥有不同的作用机理。本研究探索了Brevilin抗肿瘤活性的机理。Hochest荧光染色和流式细胞分析结果说明Brevilin是通过诱导细胞凋亡的方式来抑制肿瘤细胞的生长。对于线粒体膜电位、ROS水平和caspase-3/7的测定结果显示,Brevilin能够增加ROS水平、降低线粒体膜电位并激活caspase-3/7活性。该结果说明,Brevilin是通过线粒体途径诱导凋亡的。在RT-PCR.结果显示Brevilin对Bel-2基因家族和Fas/FasL基因的表达具有调节作用。通过Western blot分析了发现Brevilin能够抑制NF-κB核转位。综合上述的研究结果,我们认为Brevilin诱导HL60细胞凋亡是通过抑制NF-κB核转位、调节Bcl-2基因家族表达、降低线粒体膜电位、提高ROS水平最后激活caspase酶的级联反应并诱导凋亡。
化疗是肿瘤治疗中常用的方法。但是长期的化疗使肿瘤细胞产生MDR。大肠癌细胞中有较高的P-gp表达,表现一定自发性和继发性MDR。使得大肠癌细胞的MDR明显高于其它肿瘤,化疗的效果也明显低于其它肿瘤。因此,对于大肠癌的MDR的研究尤其重要。长春新碱(vineristine,VCR)是一种长春花生物碱(Vinea alkaloids),被广泛用于急性白血病和实体瘤的治疗。建立大肠癌耐药细胞株可为研究肿瘤细胞MDR机制提供基础。本研究经过长时间的诱导获得HCT-8细胞的VCR耐药细胞株(HCT-8NCR)。实验发现HCT-8和HCT-8NCR细胞在倍增时间和细胞周期上没有差别。但是,HCT-8/VCR对多种化疗药物均存在MDR现象。同时,HCT-8/VCR内VCR和DOX的累积能力也明显降低;在MDR1基因表达增加的情况下MRP1表达没有变化。结果说明HCT-8/VCR表现的MDR与P-gp表达增加有关。
荧光素酶报告基因法是检测基因启动子活性的一种有效的方法。具有检测速度快、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶报告基因高30-1000倍)、费用低、不需使用放射性同位素等优点。本研究建立了基于双荧光素酶报告基因法的MDR筛选模型。该模型是通过构建含有MDR1基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并同海肾荧光素酶报告基因载体共同组成双荧光素酶报告基因系统。利用脂质体法将两个载体共转染到肿瘤细胞中,利用报告基因检测系统可以测定荧光强度变化,从而反应出MDR1基因启动子的活性。因为MDR1基因的高表达可以导致MDR,因此该方法可以用于MDR逆转剂的筛选和化疗药物诱导MDR的研究。利用热处理和EGCG等对该模型进行了验证。结果显示该模型可信度高、灵敏度高及适于大规模筛选。该模型中荧光强度仅仅由MDR1启动子活性调控,适用于单一靶点的分析和研究。
针对肿瘤细胞的MDR这个肿瘤治疗中的最大难题。本文对Brevilin逆转MDR现象和作用机理进行探讨。首先对Brevilin在体内体外逆转MDR进行了分析。在对HCT-8和HCT-8/VCR细胞的MTT测试结果显示:Brevilin在体外明显逆转5FU、DDP及VCR的MDR现象;能够中等效果逆转MIT和HCPT的耐药现象。同时,在裸鼠体内建立人结肠癌细胞HCT-8/VCR实体瘤模型并证实了Brevilin体内逆转VCR耐药性的作用。
MDR的机制有多种,P-gp(MDR1)机制是发现最早和研究最为清楚的机制。但是关于YB-1激活MDR1基因的表达和产生MDR现象还没有最终确定。本文探索了Brevilin逆转MDR现象的机制,并从抑制YB-1核转位方面证明YB-1激活MDR1基因的表达和产生MDR现象。首先,通过HPLC和荧光酶标仪测定Brevilin增强细胞内VCR及DOX和R123的累积。其次,利用Westren blot分析了Brevilin对YB-1的核转位的抑制效应。第三,利用RT-PCR,双荧光素酶报告基因法、流式细胞分析法确认Brevilin能够下调MDR1基因和蛋白的表达。第四,采用EMSA法发现Brevilin能够抑制核蛋白与MDR1基因启动子的结合。综合上述结果,Brevilin首先抑制YB-1核转位,进而通过减少YB-1与MDR1基因启动子结合来解除YB-1对MDR1基因的增强作用,减少MDR1基因的表达,增强药物在细胞内的累积并逆转MDR现象。