[研究背景]子宫内膜癌是世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤,也是导致女性发病和死亡的主要原因。据统计,全球每年有近200000新发病例,且绝经后妇女子宫内膜癌的发病率仍在逐年升高。尽管子宫内膜癌的确切病因尚不清楚,但其多种相关危险因素已经得到证实,主要包括肥胖和长期无拮抗的雌激素对子宫内膜的刺激。已有报导显示,产次、口服避孕药、体重指数(BMI)、身体活动和饮食可能是80%以上子宫内膜癌的发生危险,强调了良好的生活方式对预防子宫内膜癌的重要性。尽管目前手术对早期患者具有良好的治疗效果,但晚期和复发的子宫内膜癌仍缺乏有效的治疗方法,而多局限于常规联合化疗。因此,对子宫内膜癌分子病理学的进一步认识,有助于靶向治疗的进展。而在目前所知的潜在治疗靶点中,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是子宫内膜癌治疗的主要靶点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,整合来自细胞内外的营养、生长因子、能量和应急等多种信号,从而调控细胞生长、增殖、存活和代谢等生理活动。mTOR通过形成两个独立的信号复合物而行使其生物学功能：mTORCl和mTORC2。 mTORCl直接磷酸化下游底物S6K1和4E-BP1,从而在蛋白质翻译起始起着关键作用,并对雷帕霉素敏感。mTORC2的功能尚不清楚,但Akt的丝氨酸S473位点可以被mTORC2磷酸化激活,从而调节细胞存活和细胞运动。mTORC2对急性雷帕霉素的抑制不敏感。作为关键的药物靶点,mTOR在子宫内膜癌中的表达上调,并在肿瘤的发生发展中至关重要。临床试验显示,mTORC1抑制剂对疾病的治疗作用并不理想,部分原因在于mTORC2的AKT正反馈途径能够持续解除mTORC1抑制剂对mTORC1的抑制作用。因此,第二代可以直接作用于mTOR的mTORC1/2双抑制剂已被研制并已进入临床试验阶段。omega-3(n-3)和omega-6(n-6)多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是人体的必须脂肪酸。实验室和动物研究指出,长链n-3多不饱和脂肪酸PA (eicosapentaenoic acid)和DHA(docosahexaenoic acid)可以抑制多种癌症的发生。与之相反的是,n-6多不饱和脂肪酸AA (arachidonic acid)则表现出促进肿瘤生长和发展的作用。自工业革命后,西方饮食中总脂肪摄入量和n-6/n-3PUFAs的比例显著增加,是促进肥胖、炎症和癌症发病的原因之一。流行病学研究显示,增加鱼类或鱼油(n-3PUFAs)的摄取能够降低结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症的发生风险,此外,临床前模型的研究亦证实了n-3PUFAs的抗肿瘤作用,从而促进了n-3PUFAs用于临床预防和治疗肿瘤的发展。尽管饮食中n-3PUFAs在多种癌症中的作用已引起广泛关注,并证实了n-3PUFAs具有预防肥胖的作用,但对于-3PUFAs与子宫内膜癌之间相互关系的研究却非常有限。最近的流行病学研究提示,增加饮食摄入和外源性补充的EPA和DHA可能具有降低子宫内膜癌发生风险的作用,但目前尚无n-3PUFAs对子宫内膜癌作用的临床前模型的研究。我们之前所构建的一种携带fat-1基因的转基因小鼠模型,通过表达n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,将n-6转化为n-3PUFAs而获得内源性n-3PUFAs,从而不需在饮食中添加n-3PUFAs来用于n-3PUFAs生物学特性的研究。此外,我们最近研究发现,n-6PUFAs(AA)能够激活mTORC1/2信号通路,在乳腺癌的发生和血管生成中起着关键作用。在本实验临床前模型的研究中,我们旨在阐明n-3PUFAs、fat-1基因的表达对子宫内膜癌mTORCl/2信号通路和肿瘤发病机制及进展的作用。[研究结果]1.外源性n-3PUFAs在体外和异种移植瘤模型中抑制子宫内膜癌细胞的生长为了研究-3PUFAs抑制子宫内膜癌的潜在保护作用,我们首先检测了DHA对子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2增殖的影响。我们发现DHA能够抑制上述子宫内膜癌细胞系的增殖,并呈浓度时间依赖性。此外,克隆形成实验进一步证实DHA具有抑制子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2克隆形成的作用,该作用呈现浓度依赖效应。上述结果说明,DHA能够在体外有效地抑制子宫内膜癌细胞系的生长。为了进一步在体内确认n-3PUFAs对子宫内膜癌细胞系生长的抑制作用,我们通过在裸鼠皮下植入HEC-1-A和RL95-2细胞建立了子宫内膜癌异种移植瘤模型。结果显示,饮食摄入的n-3PUFAs(lg/kg/d)有效地抑制了子宫内膜癌移植瘤的生长并降低了肿瘤的平均重量和体积。说明饮食摄入的n-3PUFAs能够在体内抑制子宫内膜癌细胞的生长。以上结果表明,DHA和膳食：n-3PUFAs能够在细胞培养和动物模型中有效地抑制子宫内膜癌细胞的生长。2.内源性产生的n-3PUFAs在体外和异种移植瘤模型中抑制子宫内膜癌细胞的生长饮食和营养补充剂中包含的多种营养物质和其他成份可能会相互影响,从而增加了评估的复杂性。fat-1转基因的表达能够将n-6转化为n-3PUFAs,因此在增加n-3PUFAs的同时降低n-6/n-3的比例,成为良好的可控的研究模型而无需限制饮食。为了进一步确认n-3PUFAs对子宫内膜癌生长的影响,我们建立了能够产生内源性n-3PUFAs的子宫内膜癌细胞培养和移植瘤模型。首先,我们将携带fat-1基因的重组腺病毒或不带fat-1基因的空载病毒(Ad-fat-1或Ad)分别感染子宫内膜癌细胞系HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2,检测细胞的增殖和克隆形成。结果显示,在所检测的子宫内膜癌细胞系中,与感染空载病毒的细胞比较,表达fat-1的细胞增长率和克隆形成率显著降低。其次,我们建立了fat-1转基因的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。脂肪酸成份分析显示,与缺少fat-1基因表达的SCID小鼠比较,SCID-fat-1小鼠n-3/n-6PUFAs的比例显著增加。有趣的是,在SCID小鼠的子宫内膜癌异种移植瘤模型中,尽管对照组SCID小鼠第31天移植瘤的平均体积达到223mm3,我们在SCID-fat-1小鼠中并未见肿瘤生长。说明体内产生的高水平i-3PUFAs抑制了子宫内膜癌细胞的增殖和存活。以上结果明确显示,内源性产生的n-3PUFAs能够在体外和体内抑制子宫内膜癌细胞的生长。3. n-3PUFAs抑制子宫内膜癌细胞的迁移转移是子宫内膜癌患者死亡和发病的主要原因。癌细胞侵犯周围组织和血管是肿瘤转移的初始阶段,这一过程则需要癌细胞的迁移。为了研究n-3PUFAs对子宫内膜癌细胞迁移的潜在作用,我们采用划痕实验检测了DHA在无血清培养基中对细胞迁移的影响。结果显示,25μ mol/L DHA处理的]HEC-1-A和HEC-1-B细胞填补空白划痕的速度小于对照组,说明DHA抑制了子宫内膜癌细胞的迁移。细胞迁移transwell试验进一步证实了这一结果,采用血清饥饿抑制细胞增殖以便于细胞运动性的检测,用结晶紫染色量化DHA处理24小时后迁移至下室的细胞。结果显示,DHA明显抑制了子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和HEC-1-B的迁移能力。此外,划痕实验亦显示,感染了表达fat-1腺病毒的HEC-1-A和HEC-1-B细胞的迁移速度慢于感染空载病毒的细胞,说明内源性n-3PUFAs抑制了子宫内膜癌细胞的迁移。以上结果均表明,n-3PUFAs能够有效地抑制子宫内膜癌细胞的迁移。4. n-3PUFAs在体内和体外促进子宫内膜癌细胞的凋亡目前已发现n-3PUFAs能够在多种肿瘤细胞中促进细胞凋亡,因此我们进一步检测了n-3PUFAs是否在子宫内膜癌细胞和移植瘤中同样具有促凋亡作用。我们发现在血清饥饿条件下,DHA能够增加HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2细胞的死亡,并呈剂量依赖性。同时,DHA使多聚ADP核糖聚合酶(]ARP)的裂解明显增加,该作用表现出浓度时间依赖效应。提示DHA在体外促进了子宫内膜癌细胞系的凋亡。此外,我们还检测了n-3PUFAs在移植瘤模型中对凋亡的影响,结果显示在n-3PUFAs处理组的小鼠肿瘤组织中,PARP的裂解明显增加,证实n-3PUFAs促进了子宫内膜癌移植瘤的细胞凋亡。因此,我们认为n-3PUFAs能够在体内和体外促进子宫内膜癌细胞的凋亡。5. n-3PUFAs抑制了子宫内膜癌细胞系和移植瘤的mTORCl/2信号通路目前研究已发现,mTOR信号通路在子宫内膜癌的发生发展中扮演着重要角色,并已揭示其临床靶向治疗的优势。我们最近研究报导了n-6PUFAs激活mTORCl/2信号通路在乳腺癌肿瘤发生和血管生成中的关键作用,由此我们猜想n-6PUFAs是否能够激活子宫内膜癌细胞系的mTORC1/2信号通路?检测结果显示,AA(n-6PUFAs)能够强烈增加mTORC1相关蛋白S6(S235/236)以及mTORC2关蛋白Akt的丝氨酸位点473的磷酸化水平。目前已有研究证实,n-3PUFAs具有与n-6PUFAs相反的作用,因此我们进一步检测了n-3PUFAs(DHA)是否能够抑制子宫内膜癌细胞系的mTORCl/2信号通路。结果显示,在HEC-1-A细胞中,DHA能够迅速抑制AA对P-S6(S235/236)和P-Akt(S473)的激活作用,并表现出浓度依赖性。此外,我们还检测了内源性产生的n-3PUFAs对子宫内膜癌细胞系mTORC1/2信号通路的影响。与感染空载病毒的对照组细胞比较,感染了fat-1cDNA的HEC-1-A细胞的S6(S235/236)和Akt(S473)的磷酸化水平明显降低。以上结果说明,外源性和内源性n-3PUFAs均能够同时靶向作用于子宫内膜癌细胞系的mTORC1和mTORC2信号通路。我们还进一步检测了-3PUFAs是否能够在体内抑制mTORC1/2信号通路。在子宫内膜癌移植瘤模型中,高摄入n-3/n-6PUFAs小鼠肿瘤组织的S6(S235/236)和Akt(S473)的磷酸化水平降低,提示n-3PUFAs抑制了mTORC1和mTORC2信号通路。此外,SCID-fat-1小鼠肝组织的S6(S235/236)和Akt(S473)磷酸化水平低于SCID小鼠。说明mTORC1和mTORC2信号通路是n-3PUFAs在体内的作用靶点。我们认为, n-3PUFAs对mTORC1/2信号通路的抑制作用可能是导致n-3PUFAs抑制子宫内膜癌生长的原因之一。综上所述,这些结果表明DHA和内源性产生的-3PUFAs均能够在体外和体内靶向作用于mTORC1/2信号通路。[研究结论]1.膳食和内源性产生的n-3PUFAs能够在体外和体内有效地抑制子宫内膜癌细胞的生长、迁移并促进子宫内膜癌细胞的凋亡,为n-3PUFAs用于子宫内膜癌的治疗提供了临床前证据。2. mTORC1/2信号通路是n-3PUFAs在子宫内膜癌中的作用靶点之一。3.本研究结果为n-3PUFAs用于子宫内膜癌防治的临床干预提供了有力地理论基础。