山东省桑萎缩、枣疯病及其它三种植原体的分子检测与鉴定

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本论文利用分子生物学手段对与山东省桑黄化型萎缩病、枣疯病、苦楝丛枝、苋菜褪绿和国槐丛枝相关的植原体进行了检测与鉴定。对采自山东泰安、宁阳、新泰的表现黄化、萎缩症状的桑树植株总DNA进行secY基因PCR扩增,分别得到约1.4kb的特异片段,将片段克隆后进行序列测定,表明该片段长1361bp,包含secY基因1242bp,编码414个氨基酸。通过构建系统进化树、同源性比对及利用9种限制性内切酶进行模拟RFLP分析,初步确定该植原体属于secYI-B亚组,在亚组水平上进一步明确了桑黄化型萎缩病植原体的分类地位。secA基因扩增得到842bp的目的片段,编码280个氨基酸,基于secA基因的分析结果表明桑黄化型萎缩病植原体属于16SrI-B亚组,与基于16S rRNA分析结果一致。利用FD9f/r引物对采自山东11个地区的枣疯病样品进行secY基因的PCR扩增,并进行了序列测定,结果表明,该特异片段大小为1421bp,对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和模拟RFLP分析,结果显示山东枣疯病植原体属于secYV-C亚组,与secYV-B亚组的樱桃致死黄化(CLY5)和secYV-N亚组的桃树致死黄化印度分离株系(PY-In)的亲缘关系最近,在亚组水平上进一步明确了山东枣疯病植原体的分类地位。secA基因扩增得到836bp的特异片段,编码277个氨基酸,分析结果表明枣疯病植原体属于16SrV组,与已报道结果一致。对苋菜褪绿植原体进行tuf、secY和secA基因的PCR扩增,分别得到大小约0.8 kb、1.4 kb和0.8 kb的目的片段并进行了序列测定。通过序列同源性比对、构建系统进化树及模拟RFLP分析,确定该植原体属于tufI-B和secYI-B亚组,并发现其基因序列与桑黄化型萎缩病植原体高度同源。以山东苦楝丛枝病病株总DNA为模板,进行PCR扩增和序列测定,分别得到16S rRNA (1432 bp)、核糖体蛋白基因rp (1240 bp)、延伸因子基因tuf (842 bp)、转运蛋白基因secY (1361 bp)和转运蛋白基因secA (842 bp)的序列。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和RFLP分析,结果显示山东苦楝丛枝植原体属于16SrI-B、rpI-B、tufI-B、secYI-L亚组。通过电镜观察和PCR检测,证明国槐丛枝病的病原为植原体,通过对16S rRNA基因、rp基因、secY基因和secA基因进行序列分析发现,国槐丛枝植原体属于16SrV-B、rpV-C、secYV-C亚组。
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