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脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,又称内毒素,是诱发炎症反应的主要原因,过度的炎症反应会使生物体患脓毒症等疾病,甚至会导致生物体死亡。抗菌肽是生物体先天性免疫系统的重要组成成分,具有分子量小、理化性质稳定、对哺乳动物没有毒性、广谱的杀菌活性、自身不易引发耐药性及抗炎等特性。本实验室前期研究发现:temporin-1CEb四种改造肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2具有很好的杀菌活性及溶血性低等特性。四种抗菌肽分别带5-6个净正电荷,可以与带负电荷的LPS结合。所以本论文以人单核细胞U937为研究模型,探究四种抗菌肽对LPS介导的炎症反应的影响及其作用机制。四种抗菌肽对U937细胞毒性实验结果表明,L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2对U937细胞的毒性很小。当抗菌肽在低浓度时,基本对细胞无毒性;当抗菌肽在高浓度时,L-K5,L-K6V1,L-K6V2对细胞的毒性不大,细胞的存活率仍然达到85%左右,杀伤力最强的L-K6处理的细胞存活率也能达到70%。说明这四种抗菌肽都能作为抗炎的实验材料。LPS侵入生物体内后,可以激活免疫细胞,诱使其释放炎症因子,如TNF-α、IL-8、NO等,进而引发炎症。我们的实验结果显示抗菌肽L-K6,L-K5,L-K6V1,L-K6V2能够明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-8、NO的释放。即使在低浓度20μM时,四种抗菌肽也能很好的抑制TNF-α、IL-8、NO的释放,其中,L-K6的抑制能力最强。综上可见,四种抗菌肽都有抑制LPS诱导炎症反应的能力。圆二色谱(CD)和等温滴定量热仪(ITC)测定四种抗菌肽与LPS的结合能力。CD实验结果显示四种抗菌肽在SP缓冲溶液中均呈无规则卷曲结构,但在LPS溶液中,四种抗菌肽的二级结构呈现规则的α-螺旋结构,说明LPS可以诱导抗菌肽形成规则结构;ITC实验表明抗菌肽的正电荷可以通过静电作用与LPS的负电荷结合,其中L-K6和L-K6V1与LPS的结合能力强于L-K5和L-K6V2与LPS的结合能力。四种抗菌肽都能使LPS聚集体解聚,L-K6处理后,直径在6000nm大小的LPS全部消失,L-K5解聚程度相对较弱。四种抗菌肽都能很好的抑制LPS与细胞结合,其中L-K6的抑制能力最强,L-K5的抑制能力相对较弱。细胞流式实验也证明四种抗菌肽通过与CD14的相互作用,直接抑制了LPS与细胞炎症信号传导通路受体CD14的结合,L-K6和L-K6V1的抑制效果强于L-K6V2和L-K5。RT-qPCR检测抗菌肽对MyD88、IκK、NFκB表达的影响。实验结果表明:抗菌肽能够不同程度的抑制MyD88、IκK、NFκB的表达,其中L-K6的抑制能力最强。