阴道毛滴虫与人型支原体共生关系及其相关生物学特性的研究

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阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)是一种寄生于人体阴道及泌尿道的鞭毛虫,全球每年有超过2亿人感染该虫。阴道毛滴虫引起的疾病称为阴道毛滴虫病,是最常见的非病毒性性传播疾病(STD),占全世界每年新发STD患者的50%以上。阴道毛滴虫除引起滴虫性阴道炎外,还会增加感染如艾滋病和乙型肝炎等其他性传播疾病的机会,因而对人体危害甚大。目前,甲硝唑仍是治疗滴虫病的首选药物,但临床上已发现有不少对甲硝唑的抗性株。许多实验室开始关注甲硝唑抗性产生的原因及机制,但毛滴虫抗性的发展过程仍不清楚。人型支原体(Mycoplasmahominis)也是一种常见的寄生于人体泌尿道和生殖道的病原体。由于人型支原体与阴道毛滴虫这两种均营寄生生活的病原体间共生关系的发现,我们认为很有必要重新评估它们在流行病学、遗传和生理方面的相互影响。研究阴道毛滴虫的抗药性和致病性对临床诊断与治疗显得尤为重要和迫切。本论文侧重于研究阴道毛滴虫与体内共生的人型支原体之间的相互关系,分析了共生关系对毛滴虫的抗性发展过程和分子进化分析的影响,并对毛滴虫的蛋白水解酶谱、免疫逃避机制,遗传变异等进行了深入的研究。 本研究通过对28株阴道毛滴虫虫株分析结果显示,流行中国(广州)的阴道毛滴虫体内共生的人型支原体可能与甲硝唑抗性之间存在相关性(p=0.029)。28株阴道毛滴虫虫株中,有14株被证明感染了人型支原体,感染率为50%。在这14株人型支原体阳性的阴道毛滴虫虫株中,包括4个抗性虫株和3个甲硝唑敏感性降低的虫株。另外,人型支原体感染的阳性虫株,其甲硝唑抗性的平均值(22.1μg/ml)约10倍于阴性虫株(2.4μg/ml)。这一相关性也被RAPD的基因多态性分析所证实,虫株的甲硝唑抗性值(p=0.0038)及感染人型支原体(p=0.033)这两种表型与虫株在树状聚类图上的位置有明显的相关性。而ITS的点突变与人型支原体感染和甲硝唑抗性之间没有明显的相关性(p>0.05)。 我们的研究结果显示人型支原体在毛滴虫体内的共生显著地影响了毛滴虫的RAPD图谱(p=0.002)及其后的分子进化分析(p=0.003)。通过分析用强力霉素处理前后感染人型支原体的阴道毛滴虫的RAPD的图谱变化,发现图谱中33.6%的扩增条带是来源于人型支原体,而且人型支原体去除后,毛滴虫虫株间的遗传相似系数从70%增加到75%(p=0.003),显示它们有着更为密切的遗传关系。利用虫株处理前后的RAPD数据构建的6株阴道毛滴虫的系谱树状图,显示出不同的聚类方式(p=0.003)。因此,我们认为,使用RAPD方法分析毛滴虫的基因多态性时,应首先检测其是否感染人型支原体,以免得出错误的结论。 阴道毛滴虫蛋白水解酶分析结果表明,水解酶的活性表现出强烈的pH依赖性,表现在毛滴虫具有强烈的酸性蛋白水解酶活性,但缺乏碱性蛋白水解酶活性。虫株碱性蛋白水解酶的缺乏可能是生物适应环境长期进化的结果。虽然,每个虫株的酸性蛋白水解酶谱都比较近似,但活性有显著差异。我们的结果提示毛滴虫可能通过降解特异抗体(IgG)来逃避宿主对它的攻击,其降解能力呈现时间和浓度依赖性,且不同虫株降解IgG的能力有量的差别。 率先利用MGE-PCR方法研究阴道毛滴虫虫株间的分子差异,结果显示MGE-PCR较之RAPD分析可检测到虫株间更多的遗传变异度(平均遗传距离分别为49.3%和31.4%),该法具有良好的稳定性与重复性。因此,MGE可作为种内遗传变异的分子标记,为毛滴虫诊断及进化关系分析等提供更多的理论依据。 通过分析流行中国(广州)的阴道毛滴虫虫株的核糖体基因序列(ITS、28SrRNA),进一步确证它们的高度保守性,同时表明了虽然毛滴虫是一种古老的真核生物,但可能是最近才开始出现分歧。 本论文首次发现阴道毛滴虫感染人型支原体与其甲硝唑抗药性之间存在相关性,这一发现对阴道毛滴虫流行病学及其相关的基础研究具有重要的指导意义。通过深入研究人型支原体在阴道毛滴虫体内的共生对毛滴虫分子进化的影响,表明共生的人型支原体显著地改变了毛滴虫的分子图谱分析的结果,指出使用RAPD方法分析毛滴虫的基因多态性时,有必要检测其是否感染人型支原体。本研究不但填补了国内阴道毛滴虫蛋白水解酶谱研究的空白,也探讨了MGE技术作为毛滴虫种内遗传变异的分子标记的可行性,并认为MGE是遗传变异与进化分析的理想的遗传标记。
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