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β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中。微生物β-甘露聚糖酶是β-1.4-D-甘露聚糖(β-1.4-D-mannan mannanohydrolase,EC.3.2.1.78)的简称,是一个被研究相对较晚的酶类。Ma Y等[1]报道嗜碱芽孢杆菌N 16-5(Bacillus sp.N16-5)的碱性甘露聚糖酶的核酸序列和酶学性质。在本研究中,将该基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭诱导型质粒pDG148-Stu构建成重组质粒pDG-man,然后将重组质粒分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),在大肠杆菌JM109中经0.8 mmol/L的IPTG诱导后酶活可达4.5 U/mL。相同条件下,重组大肠杆菌DE3-RIL(pDG-man)表达碱性β-甘露聚糖酶水平接近大肠杆菌JM109(pDG-man)的2倍。该基因在枯草芽孢杆菌中得到了分泌表达。在LB培养基中进行诱导培养后可以表达19.2 U/mL碱性β-甘露聚糖酶。为了继续对碱性β-甘露聚糖酶进行高表达研究,试验采用了芽孢杆菌发酵培养基来进行产酶研究,初步诱导酶活达到29.32 U/mL,通过对发酵条件的优化,该重组枯草芽孢杆菌的产酶水平有了大幅度的提高,最高可达110.02 U/mL。实验表明重组枯草芽孢杆菌的诱导表达周期为5天(其中4天为诱导产酶期),此后酶量不再增加,酶活保持稳定,恒定在一个最高水平,在之后的2天内下降幅度不超过5%。产酶过程中葡萄糖和豆饼粉加量对酶活影响很大,实验结果表明最佳葡萄糖加量为20 g/L,最佳豆饼粉加量为80 g/L。另外摇瓶装液量对重组枯草芽孢杆菌产碱性β-甘露聚糖酶的影响很大,试验结果显示500 mL的摇瓶装量50 mL时酶活水平最高。说明重组枯草芽孢杆菌发酵产酶对氧的需求很大。植酸酶方面,在本研究中亚克隆了粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的植酸酶基因(来自于重组质粒pPIC9K-phy),将其分别与pET-28a和pBL-WZX构成重组质粒pBL-phy和pET-phy,在大肠杆菌中没有得到功能表达,SDS-PAGE没有得到表达条带。