番红花（Crocus sativus L.）为鸢尾科番红花属草本植物,又称西红花,其药用部位柱头不仅是国际市场上的名贵香料,也作为传统药材在多个国家使用,具活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效。西红花柱头的产量极低,仅占整朵花重量的7.4%,采摘完柱头的占总重量90%以上的其余花部被丢弃,造成了极大的资源浪费。文献报道,西红花去柱头花部富含黄酮、酚酸和生物碱等成分,具有抗氧化、抗炎和保肝等多种药效活性。对西红花去柱头花部进行开发利用,不仅可以发现其新的活性,还可避免资源浪费和环境污染。高尿酸血症是由于体内嘌呤代谢紊乱和尿酸（uric acid,UA）代谢障碍引起的血中UA水平过高的状态。近年来,高尿酸血症的发病率持续上升,成为继高血压病、高脂血症和糖尿病之后的第四大常见基础代谢性疾病。临床上治疗高尿酸血症的药物主要有三大类,分别为黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XOD）抑制剂、尿酸盐阴离子转运蛋白抑制剂和尿酸氧化酶,其中代表性药物是别嘌呤醇。然而,这些临床用药大多具有副作用或不良反应,对机体造成重大负担。越来越多的实验表明中草药对高尿酸血症有较好的治疗效果,且与西药相比副作用小,可持续服用时间长,因此从中草药及天然产物中寻找治疗高尿酸血症的药物引发了研究者的关注。在前期药效活性筛选中,我们发现西红花去柱头花部醇提物对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠具有初步的降尿酸作用,其主要成分黄酮被报道具有抗XOD活性,可能是发挥活性的成分,有待深入研究。因此,本论文制备了西红花去柱头花部黄酮提取物,对其化学成分进行了定性定量分析;考察了黄酮提取物主要成分在大鼠体内的代谢表征;采用3个高尿酸血症动物模型,考察了黄酮提取物对高尿酸血症小鼠/大鼠的作用,并从对相关靶蛋白、内源性代谢物及菌群的影响入手,探讨了黄酮提取物抗高尿酸血症的机制,为开发西红花新药用部位提供实验依据。1黄酮提取物的制备以主要黄酮成分的含量及抗氧化活性为指标,对黄酮提取物的制备方法进行了优化,确定了超声提取、大孔树脂纯化的制备方法。2黄酮提取物化学成分定性定量分析采用UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS法,对原料药和黄酮提取物的化学成分进行了定性分析。从黄酮提取物中检出了 52个黄酮类成分、8个含氮成分、10个多元醇类成分以及42个挥发性成分,与原料药中成分大体相同。采用HPLC法对提取物的两个主要成分kaempferol-3-O-sophoroside（KS）和delphinidin-3,5-di-O-glucoside（DG）进行了定量分析,含量分别为 50.19%和2.20%,较原料药分别提高了 10倍和4倍;提取物的抗氧化能力也较原料药显著提高（DPPH清除率提高了 5倍;ORAC值提高了 100倍）。3黄酮提取物中主要化学成分在大鼠体内的代谢表征采用UPLC-Q-TOF-MS技术,对大鼠灌胃黄酮提取物后的血中成分进行了检测,推测了 12个入血成分,包括11个黄酮类成分（3个黄酮糖苷类及8个代谢产物）和1个生物碱。建立了 UHPLC-MS/MS方法,对5个黄酮原型成分,即,kaempferol-3-O-sophoroside-7-O-glucoside、quercetin-3-O-sophoroside、KS、kaempferol-3-O-glucoside、kaempferol 和 3 个Ⅱ相 代 谢产 物kaempferol-3-O-glucuronide、kaempferol-di-O-glucuronide、kaempferol-O-sulfate-O-glucuronide在大鼠体内的药代动力学进行了研究;通过与单体化合物KS和kaempferol的药代动力学参数的比较,考察了提取物共存成分对上述两个目标化合物体内代谢的影响。实验结果显示,4个黄酮糖苷化合物在血浆中吸收较差,消除较快,大部分转化成苷元及Ⅱ相代谢产物;虽然提取物中kaempferol的含量极低,但在血浆中却有较高的血药浓度,表明山柰酚糖苷化合物在血中可分解为kaempferol。与糖苷化合物相比,3个Ⅱ相代谢产物的达峰时间更长（糖苷化合物在4 h前达峰,Ⅱ相代谢产物在6h后达峰）,血药浓度更高,其中代谢产物kaempferol-3-O-glucuronide的最大血药浓度约为原型成分KS的20倍。此外,提取物中的共存成分影响了 KS和kaempferol的体内代谢表征,与KS单体相比,黄酮提取物中KS的吸收减少,消除加快,血浆浓度-时间曲线下面积降低了约60%（由441.4降为174.4 h·μg/L）,而清除率增加了约2倍（由271.7增加到了 758.6 L/h/kg）。与kaempferol单体相比,黄酮提取物中kaempferol的吸收增加且体内滞留时间延长,血浆浓度-时间曲线下面积增加了约7倍（由97.1增加到753.9 h·μg/L）,平均滞留时间增加了 1倍以上（由4.0增加到10.7 h）。研究结果显示,提取物中的共存化合物减弱了黄酮糖苷化合物的体内吸收,加速了其消除过程;加强了黄酮苷元化合物的体内吸收,减缓了其消除过程。4黄酮提取物抗高尿酸血症活性、机制及物质基础研究从抑制UA分解、补充外源性UA前体物质和抑制UA排泄等角度选择造模药,制备了 3个高尿酸血症动物模型,即,氧嗪酸钾致小鼠急性高尿酸血症模型（预防给药）、腺嘌呤联合乙胺丁醇致大鼠高尿酸血症模型（预防给药）和氧嗪酸钾致大鼠高尿酸血症模型（治疗给药）,考察了黄酮提取物对上述高尿酸血症动物的作用,探讨了作用机制。4.1对高尿酸血症小鼠/大鼠生化指标的影响黄酮提取物能有效降低高尿酸血症小鼠/大鼠血和小肠中的UA水平,抑制XOD活性;改善肾功能和炎症状态,保护肾脏;提高机体的抗氧化能力及降低血脂水平。4.2对相关靶蛋白的影响采用Western Blot和RT-qPCR法,考察了黄酮提取物对氧嗪酸钾致高尿酸血症大鼠的尿酸相关蛋白XOD、尿酸盐转运蛋白1（urate transporter 1,URAT1）、葡萄糖转运蛋白9（glucose transporter 9,GLUT9）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G2（ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2）及其 mRNA 表达的影响。研究结果显示,黄酮提取物能显著降低肝脏中XOD、肾脏和回肠中URAT1和GLUT9的表达;提高肾脏和回肠中ABCG2的表达,提示这四个蛋白可能是黄酮提取物降UA的关键靶点。4.3对内源性代谢物的影响采用非靶向代谢组学技术,研究了黄酮提取物对腺嘌呤联合乙胺丁醇、氧嗪酸钾致高尿酸血症大鼠血清内源性代谢物的影响。研究结果显示,高尿酸血症引起了大鼠血清内源性物质,尤其是脂类（甘油磷脂和脂肪酸）和氨基酸类化合物的代谢异常,黄酮提取物可回调 phosphatidylcholine、sphingolipids、carnitine、aspartic acid、ceramide、palmitic acid、tyrosine 和 citrulline 等差异代谢物的水平,影响氨基酸和脂质代谢相关通路,其中,alanine,aspartate and glutamate metabolism、arginine biosynthesis、glycine,serine and threonine metabolism、histidine metabolism、glyoxylate and dicarboxylate metabolism 这五条代谢通路与嘌呤/UA代谢密切相关。4.4对肠道菌群的影响采用16S rRNA测序法,对氧嗪酸钾致高尿酸血症大鼠的粪便肠道菌群进行了研究,考察了黄酮提取物对菌群代谢的影响。研究结果显示,高尿酸血症引起了大鼠肠道微生物群代谢紊乱,降低了菌群的多样性;而黄酮提取物显著提高了菌群的多样性,回转了Roseburia、Clostridiumsp.和 Gastranaerophilales 等 30 个差异菌的异常水平,改善了菌群的代谢失衡。此外,相关性分析结果显示,差异菌丰度与血清内源性差异代谢物的水平高度相关,表明菌群与宿主代谢密切相关。4.5机制的探讨对上述实验数据进行相关性分析,探讨了黄酮提取物降UA的机制,与其调控UA相关靶蛋白（XOD、URAT1、GLUT9和ABCG2）和调节与宿主代谢（脂质和氨基酸）密切相关的肠道菌群有关。结合药效学和药动学的研究结果,推测KS、kaempferol和Ⅱ相代谢产物可能是黄酮提取物发挥抗高尿酸血症作用的物质基础。综上所述,本文采用超声提取加大孔树脂纯化法制备了西红花去柱头花部黄酮提取物,其中KS的含量可达50%以上;对黄酮提取物在大鼠体内的代谢情况进行了表征,鉴定/推测了 12个入血成分,对其中5个黄酮成分及3个Ⅱ相代谢产物进行了药代动力学研究,发现黄酮化合物在体内吸收较差、代谢较快、主要转化为Ⅱ相代谢产物,且提取物的共存成分对目标成分的体内代谢有较大的影响;考察了黄酮提取物对高尿酸血症小鼠/大鼠的作用,发现黄酮提取物可显著降低血及小肠中UA的水平,可能与其调节生成、转运UA的蛋白及调节肠道菌群,影响内源性代谢产物相关;KS、kaempferol和Ⅱ相代谢产物可能是发挥抗高尿酸血症作用的物质基础。