动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种以脂质代谢异常和炎症细胞浸润为主要特征的慢性炎症性疾病。炎症反应贯穿于其发生、发展的整个过程。抗炎干预成为动脉粥样硬化防治的一个重要方向,控制或阻断炎症反应可有效延缓动脉粥样硬化的发生、斑块破裂和血栓的形成。研究发现,巨噬细胞在动脉粥样硬化发生、发展的炎症反应过程中起着十分重要的作用,其参与了脂质沉积、泡沫细胞形成、动脉粥样硬化斑块的形成与稳定等一系列病理生理过程。通过特异性的抑制M1型诱导因子或增强M2型诱导因子的表达水平,均可有效缓解AS的发生发展。流行病学调查显示,随着蠕虫感染率的下降,人群过敏性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病的发病率呈上升的趋势。蠕虫感染或蠕虫来源的分子对自身免疫性、过敏性及代谢性等炎症相关疾病有明显的干预作用,这为此类疾病的预防和治疗提供了新的思路。既往的研究结果显示,钩虫感染及其来源产物可通过诱导宿主产生特异性的II型免疫应答、M2型巨噬细胞极化有效干预克罗恩病、过敏性哮喘及宿主脂质代谢等。因此,本研究提出通过钩虫感染及其来源蛋白诱导宿主产生II型免疫应答及M2型巨噬细胞极化从而干预动脉粥样硬化发生发展的科研假说。为验证以上假说,本研究通过体外细胞实验,从细胞形态、mRNA、细胞标志物、细胞因子分泌等方面观察巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导巨噬细胞极化情况;进一步应用ApoE^-/-小鼠动物模型,在动脉粥样硬化形成过程中和形成后,分别采用巴西日圆线虫感染及其来源蛋白等进行干预,通过动脉、肝脏组织病理切片、血清脂质、细胞因子等水平的检测,综合评估巴西日圆线虫感染及其来源产物干预动脉粥样硬化发生发展的效果。一、巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞极化的研究维持巴西日圆线虫培养的实验室循环,无菌条件下收集L3和L5虫体,分别制备来源蛋白;利用THP-1细胞的体外培养体系,THP-1细胞经佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA,浓度500 ng/mL）刺激培养后转化为贴壁状态的M0细胞,分别采用脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）+IFN-γ（浓度分别为500ng/mL和100ng/mL）、IL-4+IL-13（浓度均为100 ng/mL）、L3及L5来源蛋白（浓度均为5?g/mL）进行刺激,通过显微镜镜检、RT-qPCR、流式细胞术及ELISA等方法进行刺激后细胞形态学观察、M1/M2型巨噬细胞特异性基因mRNA表达水平检测、细胞标志物的检测和分泌M1/M2型细胞因子含量的检测,观察巴西日圆线虫来源蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞的极化方向。结果显示THP-1经PMA刺激培养转化为贴壁的M0细胞后,经LPS+IFN-γ刺激培养后呈现特征性的M1型极化的改变,呈扁平圆形;经IL-4+IL-13刺激培养后呈现特征性的M2型极化的改变,呈修长梭形;经L3和L5蛋白刺激培养后均呈现特征性的M2型极化的改变,呈修长梭形;LPS+IFN-γ刺激组的M1型巨噬细胞数量高于其他4组;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组的M2型巨噬细胞数量高于阴性对照组和LPS+IFN-γ刺激组。RT-qPCR结果显示,LPS+IFN-γ刺激组CCL2、TNF-α、IL-12b等M1型巨噬细胞相关基因mRNA表达水平显著高于其他4组,差异均具有统计学意义（P<0.001）;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组PPARγ、IL-10等M2型巨噬细胞相关基因mRNA表达水平显著高于LPS+IFN-γ刺激组,差异均具有统计学意义（P<0.05）;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组Mrc-1基因mRNA表达水平显著高于LPS+IFN-γ刺激组,差异均具有统计学意义（P<0.001）。流式细胞结果显示,阴性对照组、LPS+IFN-γ刺激组CD86阳性细胞数高于与IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组CD206阳性细胞数高于阴性对照组和LPS+IFN-γ刺激组。细胞因子检测结果显示,LPS+IFN-γ刺激组IL-1β、TNF-α等M1型巨噬细胞相关细胞因子表达水平高于IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组,差异均具有统计学意义（P<0.001）;IL-4+IL-13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组的TGF-β1、IL-10等M2型巨噬细胞相关细胞因子表达水平高于阴性对照组和LPS+IFN-γ刺激组,差异均有统计学意义（P<0.05）。研究结果表明,巴西日圆线虫的L3和L5蛋白均可在体外诱导巨噬细胞向M2型极化,提示机体感染钩虫后可能通过特异性诱导巨噬细胞极化激发抗炎作用。二、巴西日圆线虫及其来源产物干预ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化发生的研究通过高脂饲料喂养ApoE^-/-小鼠12w,建立动脉粥样硬化模型。建模第一周起,每隔2周经皮下注射L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫感染等方式干预ApoE^-/-小鼠,同时使用佐剂和PBS接种的ApoE^-/-小鼠进行对照。12w成模后,使用组织染色和细胞因子检测对动脉粥样硬化干预效果进行评估。主动脉弓切片结果显示,L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫对于动脉粥样硬化的发生均有一定的干预效果,L3蛋白干预后,斑块长度、斑块内脂质相对含量、斑块面积、坏死核心相对面积显著下降,差异均有统计学意义（P<0.05）;L5蛋白干预后,斑块长度、斑块面积显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;巴西日圆线虫感染后,斑块长度、斑块内脂质相对含量、斑块面积、坏死核心相对面积显著下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。肝脏切片结果显示,L3蛋白组、L5蛋白组能够改善脂质代谢,L3蛋白和L5蛋白干预后,肝脏内脂质相对含量均显著降低。细胞因子检测分析显示,干预组对于Ⅰ型细胞因子分泌影响效果不明显,但均一定程度上调Ⅱ型细胞因子分泌水平,L3蛋白组第12w起IL-4分泌水平显著上调,IL-10分泌水平显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）;L5蛋白组第8w起IL-4分泌水平显著上调,第4w起IL-10分泌水平显著上调,差异均具有统计学意义（P<0.05）;巴西日圆线虫感染组从第12w起IL-4分泌水平显著降上调,差异有统计学意义（P<0.05）。研究结果显示,巴西日圆线虫及其来源蛋白能够有效干预动脉粥样硬化斑块的发生,可能与巴西日圆线虫及其来源蛋白诱导产生抗炎作用的II型免疫有关。三、巴西日圆线虫及其来源产物干预ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化发展的研究通过高脂饲料喂养ApoE^-/-小鼠20w,建立动脉粥样硬化模型。建模第12w起,每隔2周皮下注射L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫感染等方式干预ApoE^-/-小鼠,同时使用佐剂和PBS接种的ApoE^-/-小鼠进行对照。20w成模后,使用组织染色、血清HDL和细胞因子检测对动脉粥样硬化干预效果进行评估。主动脉弓切片结果显示,L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫均可以干预动脉粥样硬化斑块的发展,L3蛋白干预后,斑块长度、斑块面积显著降低,差异均有统计学意义（P<0.05）;L5蛋白干预后,斑块长度、斑块面积、坏死核心相对面积显著降低,差异均有统计学意义（P<0.05）;巴西日圆线虫感染后,斑块面积显著下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。肝脏切片结果显示,只有L5蛋白组起到了改善脂质代谢的效果,L5蛋白组肝脏内脂质相对含量显著下降,而L3蛋白组和巴西日圆线虫感染组无显著差异。通过血清HDL检测分析,L5蛋白组在第16w HDL相对值高于佐剂组,第20w HDL值显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而L3蛋白组和巴西日圆线虫感染组从12到20w无显著差异（P>0.05）。细胞因子检测分析显示,L3蛋白、L5蛋白干预可以下调部分Ⅰ型细胞因子分泌水平,如第20w IL-6分泌水平显著下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;L3蛋白、L5蛋白和巴西日圆线虫干预均可以上调部分Ⅱ型细胞因子,如巴西日圆线虫感染组从第16w起IL-10水平显著上调,L3蛋白组、L5蛋白组第20w IL-10分泌水平显著上调,差异均具有统计学意义（P<0.05）。研究结果显示,巴西日圆线虫及其来源蛋白在一定程度上缓解动脉粥样硬化的发展,表现为动脉粥样硬化斑块的大小和坏死核心面积的下降,干预后特异性诱导产生的IL-10可能发挥了一定的作用。