鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）属黄病毒属,病毒编码三种结构蛋白（核衣壳蛋白C、膜蛋白前体PrM、囊膜蛋白E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。黄病毒的非结构蛋白NS5同时具有N-7与2’-O两种甲基转移酶活性,可以调控病毒复制,且2’-O甲基化可以使病毒RNA形成与宿主细胞mRNA一样的帽子结构,具有逃逸宿主天然免疫系统的识别和清除作用。目前,关于DTMUV NS5甲基转移酶活性的研究尚未见报道。本试验旨在通过筛选DTMUV NS5甲基转移酶关键活性位点,为探索将甲基转移酶调控病毒复制功能的研究奠定基础。1.DTMUV甲基转移酶重组质粒与突变型重组质粒的构建与表达选取NS5甲基转移酶活性区域片段进行扩增,该区域在黄病毒中高度保守。将扩增得到的甲基转移酶活性区段的基因片段p1克隆至原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a（+）-NS5-p1,并进行双酶切鉴定。结果显示:酶切构建重组表达质粒pET-28a（+）-NS5-p1,获得两条大小预期片段,分别为5300bp和900bp,经测序验证序列正确,表明DTMUV甲基转移酶重组质粒pET-28a（+）-NS5-p1构建成功。以构建的pET-28a（+）-NS5-p1为模板,分别选取了甲基转移酶活性区段上四分体结构的4个位点K61-D146-K182-E218进行突变,构建以pET-28a（+）为载体的突变型重组质粒pET-28a（+）-NS5-K61A、pET-28a（+）-NS5-D146A、pET-28a（+）-NS5-K182A和pET-28a（+）-NS5-E218A,经测序验证,成功构建突变型重组质粒。将构建的pET-28a（+）-NS5-p1重组质粒及其甲基转移酶活性区段上四分体重组突变质粒（pET-28a（+）-NS5-K61A、pET-28a（+）-NS5-D146A、pET-28a（+）-NS5-K182A和pET-28a（+）-NS5-E218A）分别进行蛋白诱导表达,均获得了以包涵体形式表达的大小为33 kDa酶蛋白NS5-p1、NS5-K61A、NS5-D146A、NS5-K182A和NS5-E218A。按试剂盒说明书采取稀释复性方法对表达的包涵体纯化复性,SDS-PAGE电泳结果显示,分别获得了较纯净的可溶酶蛋白。2.DTMUV甲基转移酶活性关键位点的筛选采用了同位素³²p放射性标记进行DTMUV NS5甲基转移酶关键活性位点的筛选显示:在分析N-7甲基转移酶活性(G³²ppp A-RNA转化为m7G³²pppA-RNA)时发现,与未突变组NS5-p1的酶活性相比,突变组NS5-K61A、NS5-D146A、NS5-K182A和NS5-E218A酶活性分别降为25%、0%、11.5%、33.2%。同时,在2’-O甲基转移酶活性(m7G³²pppA-RNA转化为m7G³²pppAm-RNA)的分析中发现,突变组NS5-K61A、NS5-D146A、NS5-K182A和NS5-E218A各组相对未突变组NS5-p1的酶活性均降为0%。结论:DTMUV甲基转移酶活性区段四分体结构的K61、D146、K182和E218位点均为DTMUV 2’-O甲基转移酶活性的关键位点,且D146位点还是DTMUV N-7甲基转移酶活性的关键位点。