研究背景乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤,在全球范围内乳腺癌是女性因癌症而死亡的主要原因之一。目前乳腺癌的治疗仍然是基于传统的预后预测因素如雌激素受体、孕激素受体、HER-2/neu/cerbB2原癌基因、Ki67等,但由于乳腺癌是一种复杂的异质性肿瘤,其预后受多方面因素的影响,迫切需要寻找新的有价值的预后预测指标以指导临床决策。蛋白激酶Mst(Mammalian Sterile20-like Kinase)是体内普遍表达的一种丝／苏氨酸蛋白激酶,属于人丝／苏氨酸激酶的哺乳动物STE20样激酶。首先在酵母中被鉴定,随后发现其参与大量不同的细胞功能的调节。Mstl和Mst2在体内和体外是caspase-3的直接底物,在细胞凋亡中是在caspase活化的上游和下游都起作用。通过P53途径激活Mstl可以引起细胞凋亡。PHLPP-Mstl通路在肿瘤形成和发展过程中也起着重要的作用,Mstl与PHLPP相互协同作用引起细胞凋亡。PHLPP、Akt和Mstl构成一个控制细胞凋亡和增殖微妙平衡的自抑制三角,并且是依赖于细胞类型和邻近序列的。通过苏氨酸120磷酸化,PI3K/Akt抑制Mst1介导的促凋亡信号途径。在果蝇模型中,经证实Hippo-Lats-Yorki e信号通路参与细胞过度生长,以及肿瘤的发生。在哺乳动物中与Hippo类似的是Mstl。Hippo肿瘤抑制途径是控制果蝇组织大小的一个关键的信号途径。Hippo信号途径通过促进细胞凋亡和细胞周期停滞来限制组织的大小。通过Hippo途径,Mst1的缺失导致细胞过度增殖和肿瘤形成。细胞凋亡中Mstl被凋亡蛋白酶caspases切割和激活,能诱导细胞凋亡形态上的改变如染色质凝聚,促进细胞凋亡。在大肠癌中的研究表明胞质Mstl下降与肿瘤分期中的较高的T和N分期、脉管浸润及较差的预后有关。推测其机制与Mstl诱导细胞凋亡和具有抑癌作用相关。Kim等的研究表明在淋巴瘤和白血病患者中Mstl表达减少,这也意味着Mstl的丢失在血液系统肿瘤形成过程中起作用。综上所述,蛋白激酶Mstl是恶性肿瘤凋亡途径信号通路上的一个重要环节,与细胞凋亡密切相关。其作用机制可能是与抑癌作用相关。为了探讨Mstl在乳腺癌发生发展中的作用,本研究旨在通过观察Mstl在乳腺癌中表达以及与各项临床病理因素和预后的相关性,进一步分析和评估其在乳腺癌患者中的临床及预后意义。研究目的1.免疫组化技术检测Mstl在乳腺癌组织中的表达。2.研究分析Mstl表达与不同年龄、不同肿瘤大小、不同淋巴结转移状况以及病理生物学特征(ER、PR、HER-2、P53等)的相关性。3.对所有患者的长期随访资料进行生存分析,了解Mstl对患者预后的预测价值,推测Mst1在乳腺癌发生发展中的可能作用和机制。研究方法1.选取1997年1月到1998年12月在山东大学齐鲁医院手术病理证实为原发性浸润性乳腺癌110例,所有患者均接受乳腺癌根治术或改良根治术,排除术前新辅助治疗和晚期转移患者。所有患者术后完成标准的辅助治疗,并有完整的出院后回访或电话随访资料。2.110例乳腺癌患者均为女性,发病年龄25～75岁,中位年龄46.9岁。其中40岁以上者47例,40岁以下者63例。3.根据病理肿瘤大小分为2cm及以上者,2cm以下;4.根据雌激素受体ER情况分为阴性和阳性；5.根据孕激素受体PR情况分为阴性和阳性；6.根据HER-2状况分为阴性和阳性；7.根据P53状况分为阴性和阳性；8.所有患者随访至死亡或随访期结束,中位随访时间90月。9.所有研究对象石蜡包埋标本重新切片,ER、PR、HER-2、P53状态等经过两位独立病理专家审核确定。10.本项研究所有程序取得山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准。11.免疫组化SABC法检测Mst1在乳腺癌组织中的表达：11.1将石蜡标本连续切片,片厚4μm,脱蜡至水；(1)65℃烤箱中烤片30分钟；(2)二甲苯脱蜡(共三缸,每缸各10分钟)；(3)梯度酒精脱苯(100%两缸,90%、80%、70%各一缸,依次涮过)；(4)蒸馏水冲洗；11.2新鲜配置3%H2O2,放置室温10分钟以灭活内源性过氧化物酶,然后用蒸馏水冲洗2分钟三次；11.3水浴修复：将切片放入盛有PBS缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中,在95℃水浴30分钟后拿出至室温完全冷却；11.4滴加小牛血清,37℃反应30分钟后甩去多余液体,不洗；11.5滴加一抗,4℃反应过夜；11.6PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次,滴加生物素化二抗IgG(抗鼠)37℃反应30分钟；11.7PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次,滴加试剂SABC,37℃反应30分钟,PBS洗10分钟3次；11.8DAB室温显色,镜下控制显色时间,蒸馏水冲洗；11.9滴加苏木素轻度复染60秒,取出后洗涤,在37℃恒温箱干燥过夜,中性树胶封片。12.最终切片由两位研究者独立观察评价,根据肿瘤细胞染色数目和强度进行评价。阳性细胞百分率占所有肿瘤细胞总数10%以上结果判定为阳性。13.统计分析采用SPSS18.0统计学软件。采用卡方检验分析Mstl表达与乳腺癌临床病理特征的关系。预后分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验,绘制患者的生存曲线。以Cox回归进行单因素、多因素分析。所有统计均采用双侧概率检验,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.免疫组化观察Mstl在乳腺癌组织中的表达免疫组化染色发现Mstl主要在乳腺癌细胞的胞质中发现,在110例乳腺癌患者组织标本中分别检测到Mstl染色阳性或阴性,其中30例(27.3%)呈Mst1染色阴性,其余80例(72.7%)呈阳性。2.Mstl表达与乳腺癌临床病理特征的关系分析不同年龄组(40岁以上和40岁以下)、肿瘤大小(2cm及以上,2cm以下)、淋巴结状态(无转移和有转移)以及不同ER、PR、HER-2、P53状况(阴性和阳性),我们观察到Mstl表达与上述临床病理特征无明显相关性。3.Mstl表达与乳腺癌预后的关系3.1总生存情况：Mstl阳性的患者共80例,死亡9例；Mstl阴性的患者共30例,死亡10例；3.2局部复发情况：Mst1阳性的患者10例,Mst1阴性的患者5例；3.3远处转移情况：Mst1阳性的患者15例,Mstl阴性的患者5例；3.4Kaplan-Meier生存分析：Mstl表达阴性者总生存率明显降低,Log-rank检验两者差异有统计学意义(P=0.009)。然而Mstl表达对于无复发转移生存以及无远处转移生存方面均无明显影响(P=0.112和P=0.762)。4.Cox回归无论是单因素还是多因素分析均显示了Mstl表达与总生存率存在显著的相关性：单因素分析P=0.027,多因素分析P=0.030。研究结论1.在不同的乳腺癌患者组织标本中分别检测到Mstl表达阳性或阴性。2.免疫组化染色发现Mstl主要在乳腺癌细胞的胞质中发现。3.Mstl的表达与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移状态以及ER、PR、HER-2、P53等临床病理特征无明显相关性。4.长期随访统计分析发现Mstl与乳腺癌患者总生存显著相关,Mstl表达阴性者总生存率明显降低。5.蛋白激酶Mstl可能参与了乳腺癌发生发展及凋亡的过程,有可能成为潜在的预后标志之一。