目的:1.建立以细胞增殖抑制率为筛选指标的体外筛选法,对小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞进行天然产物化合物筛选;2.探讨氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖的影响,并进一步探讨三氧化二砷诱导人肺支气管上皮细胞恶性转化的作用机制;3.探讨氯化血根碱抗小细胞肺癌的作用,及其联合帕比司他对小细胞肺癌生长的影响,并进一步探讨其抗小细胞肺癌的作用机制。方法:1.对NCI-H1688细胞进行天然产物化合物筛选实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测640个天然产物化合物对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞增殖的影响;同时,检测初筛得到的39个天然产物化合物对人正常支气管上皮细胞16HBE细胞增殖的影响。2.三氧化二砷诱导人肺支气管上皮细胞恶性转化的实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖的影响;通过实时荧光定量PCR检测氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中miR-301a表达水平的影响。同时,通过实时荧光定量PCR检测三氧化二砷对BEAS-2B细胞中miR-301a表达水平的影响;通过ELISA检测三氧化二砷处理的BEAS-2B细胞培养液中IL-6的水平;通过实时荧光定量PCR检测IL-6/IL-6抑制剂/STAT3抑制剂处理的BEAS-2B细胞中miR-301a的表达水平。采用瞬时转染技术抑制BEAS-2B细胞中miR-301a的表达,通过蛋白质免疫印迹法检测三氧化二砷处理的BEAS-2B细胞中磷酸化STAT3、总STAT3和I κ B a蛋白表达水平;采用瞬时转染技术抑制BEAS-2B-As细胞中miR-301a的表达,通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验、通过软琼脂克隆形成实验、通过transwell小室细胞迁移实验和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术,检测细胞增殖、克隆形成、细胞迁移和凋亡的情况。并且,通过蛋白质免疫印迹法检测miR-301a靶基因(SMAD4,RUNX3,PTEN,NKRF,BIM,P63,PIAS3,GADD45 α)蛋白表达水平;通过荧光素酶报告基因和蛋白质免疫印迹法检测共转染pGL3-SMAD4 3’ UTR和miR-301a模拟物的BEAS-2B-As细胞中荧光素酶活性和SMAD4蛋白表达水平。同时,采用慢病毒转染技术抑制BEAS-2B-As细胞中SMAD4的表达,通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验、通过transwell小室细胞迁移实验和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术,检测细胞增殖、细胞迁移和凋亡的情况。建立裸鼠异种移植瘤模型,设立Anti-control组和Anti-miR-301a组,测量两组肿瘤的体积,通过免疫组织化学法检测两组肿瘤组织切片中SMAD4阳性细胞数量;建立裸鼠异种移植瘤模型,设立shRNA-control组和shRNA-SMAD4组,测量两组肿瘤的体积,通过蛋白质免疫印迹法检测SMAD4、磷酸化STAT3、总STAT3蛋白表达水平。通过TCGA数据库分析腺癌和鳞状细胞癌的临床组织样本,探究miR-301a与SMAD4在肺癌组织中的相关性。3.氯化血根碱及其联合帕比司他抗小细胞肺癌的实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测氯化血根碱对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞增殖的影响;通过克隆形成实验、通过PI单染流式细胞术、通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和DAPI细胞染色、通过细胞划痕实验、通过transwell小室细胞迁移和侵袭实验,检测氯化血根碱对NCI-H1688细胞克隆形成、细胞周期分布、凋亡、运动、迁移和侵袭的影响。通过转录组测序和生物信息学分析,揭示氯化血根碱抑制人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688的作用靶点;通过实时荧光定量PCR检测氯化血根碱处理的NCI-H1688和NCI-H82细胞中CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53基因mRNA表达水平;同时,通过蛋白质免疫印迹法验证CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53蛋白表达水平。建立裸鼠异种移植瘤模型,设立对照组和氯化血根碱治疗组,测量两组肿瘤的体积和重量,通过免疫组织化学法检测两组肿瘤组织切片中CDKN1A阳性细胞数量。通过实时荧光定量PCR检测小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A基因mRNA表达水平;同时,通过蛋白质免疫印迹法验证小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A蛋白表达水平。采用慢病毒转染技术抑制NCI-H1688细胞中CDKNIA的表达,通过建立稳定表达shRNA-CDKNIA的NCI-H1688细胞株,通过CCK-8检测方法和克隆形成实验检测CDKN1A对NCI-H1688细胞增殖和克隆形成的影响。通过Oncomine及TCGA数据库分析肺癌的临床组织样本中CDKN1A基因的表达水平。通过CCK-8检测方法检测氯化血根碱联合帕比司他、吉西他滨、THZ1和(+)-JQ1对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞增殖的影响;通过PI单染流式细胞术检测氯化血根碱联合帕比司他对NCI-H1688细胞周期分布的影响;最后,通过蛋白质免疫印迹法检测氯化血根碱联合帕比司他处理的NCI-H1688细胞中CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53蛋白表达水平。结果:1.初步筛选得到39个天然产物化合物具有抑制人小细胞肺癌细胞增殖的作用,通过对比39个候选药物对正常细胞的杀伤力,并结合文献调研,发现氯化血根碱不仅能够抑制小细胞肺癌,并且对正常细胞的杀伤力小,是潜在的小细胞肺癌抑制物。2.1μM氯化血根碱处理三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞以及正常人肺支气管上皮细胞16HBE和BEAS-2B细胞后,对比三株细胞的抑制率,发现氯化血根碱能够抑制BEAS-2B-As细胞增殖,同时对正常细胞的影响较小。接着,不同浓度氯化血根碱(0.8,0.9,1,2,3μM)处理BEAS-2B-As细胞24,48,72小时,发现随着氯化血根碱作用浓度和作用时间的增加,细胞增殖抑制率逐步升高。同时,不同浓度氯化血根碱(0,0.5,1,1.5μM)处理BEAS-2B-As细胞24小时后检测miR-301a的表达,发现随着氯化血根碱作用浓度的增加,miR-301a的表达逐步下降。3.0.25μM三氧化二砷处理BEAS-2B细胞6个月,BEAS-2B细胞发生恶性转化。与未转化的BEAS-2B细胞比较,三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中miR-301a呈现高表达。同时,不同浓度三氧化二砷(0,2.5,5,10μM)处理BEAS-2B细胞12小时后检测miR-301a的表达,发现随着三氧化二砷作用浓度的增加,miR-301a的表达显著升高。并且,0.25μM三氧化二砷处理BEAS-2B细胞不同细胞传代数目,检测miR-301a的表达,发现随着三氧化二砷暴露时间的增加(10-30代),miR-301a的表达逐步升高。4.不同浓度三氧化二砷(0,5,10μM)和过氧化氢(阳性对照)处理BEAS-2B细胞24小时,通过ELISA检测细胞培养液中IL-6的水平,发现三氧化二砷10μM作用浓度时,IL-6水平最高。并且,不同浓度IL-6(0,10,50,100ng/mL)处理BEAS-2B细胞,检测miR-301a的表达,发现在IL-6的刺激下,随着IL-6作用浓度的增加,miR-301a表达显著升高。但是,STAT3抑制剂(S31-201,30μM)能够逆转miR-301a的高表达。同时,STAT3抑制剂和IL-6抑制剂(Anti-IL-6)均能逆转三氧化二砷处理BEAS-2B细胞后miR-301a的高表达。不同浓度三氧化二砷(0,5,10μM)处理分别转染Anti-control或Anti-miR-301a的BEAS-2B细胞24小时,通过蛋白质免疫印迹法检测磷酸化STAT3、总STAT3和IκBα蛋白表达,发现三氧化二砷能够激活STAT3的表达,抑制miR-301a的表达能够抑制STAT3的激活,而I κ Bα的表达没有显著差异。5.在分别转染Anti-control和Anti-miR-301a的BEAS-2B-As细胞中检测细胞增殖和克隆形成能力,以及细胞迁移和诱导细胞凋亡的能力,发现通过抑制miR-301a的表达能够抑制三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖、克隆形成和细胞迁移,并增强阿霉素诱导的细胞凋亡。6.通过检测部分已报道的mi R-301a靶基因的蛋白表达,发现在三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中,SMAD4和NKRF的表达明显低于正常BEAS-2B细胞。并且,在BEAS-2B-As细胞中,抑制mi R-301a的表达可以显著增强SMAD4的表达,而NKRF的表达无明显变化。同时,通过荧光素酶报告基因,发现共转染pGL3-SMAD4 3’ UTR和miR-301a模拟物的BEAS-2B-As细胞中荧光素酶活性明显降低,同时,SMAD4蛋白表达也明显降低。7.在BEAS-2B-As细胞中,抑制miR-301a的表达并通过shRNA敲低SMAD4的表达,可以促进细胞增殖、迁移并抑制细胞凋亡。在裸鼠异种移植瘤模型中,发现抑制miR-301a的表达能够抑制裸鼠肿瘤的生长。并且,SMAD4在Anti-miR-301a裸鼠肿瘤组织切片中的阳性细胞数明显增多。同时,在裸鼠异种移植瘤模型中,发现抑制mi R-301a和SMAD4的表达能够促进裸鼠肿瘤的生长。通过蛋白质免疫印迹法检测SMAD4、磷酸化STAT3、总STAT3蛋白表达,发现抑制miR-301a的表达能够诱导SMAD4高表达并显著抑制STAT3的激活,而抑制SMAD4的表达能够使STAT3再次被激活。同时,通过抑制BEAS-2B细胞中mmiR-301a的表达,并经三氧化二砷处理,同样发现抑制SMAD4的表达能够促进STAT3的激活。8.通过TCGA数据库获取肺癌临床患者的基因组图谱数据,与正常肺组织样本比较,发现miR-301a在肺腺癌和肺鳞癌组织样本中的表达均明显高于正常组织,而其靶基因SMAD4在肺癌组织样本中的表达则明显低于正常组织。并且,在肺腺癌中,miR-301a与SMAD4呈负相关,而在肺鳞癌中,miR-301a与SMAD4无显著的相关性。9.不同浓度氯化血根碱(0,0.9,1,2,3,4μM)处理NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞24,48,72小时,检测氯化血根碱对小细胞肺癌细胞增殖的影响,发现氯化血根碱能够抑制小细胞肺癌细胞增殖,并具有时间、浓度依赖性。同时,通过克隆形成实验检测氯化血根碱对NCI-H1688细胞克隆形成的影响,发现氯化血根碱能够抑制NCI-H1688细胞克隆形成,并且具有浓度依赖性的抑制作用。不同浓度氯化血根碱(0,0.5,1,1.5μM)处理NCI-H1688细胞24小时,通过流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况,发现随着氯化血根碱作用浓度的增加,G1期细胞比例逐渐增加,S期和G2/M期细胞比例逐渐下降,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例逐渐增加。不同浓度氯化血根碱(0,0.5,1,1.5μM)作用于已做划痕处理的NCI-H1688细胞,观察比较各浓度组0小时和24小时的划痕面积,发现对照组划痕随着时间的增加,划痕逐渐愈合,划痕面积逐渐减小;氯化血根碱处理组(0.5,1,1.5μM)划痕随着氯化血根碱作用浓度的增加,划痕愈合现象逐渐消失,划痕面积变化逐渐不明显。不同浓度氯化血根碱(0,300,400,500nM)处理NCI-H1688细胞24小时,通过transwell小室细胞迁移实验观察穿过transwell小室的细胞数量,发现与对照组比较,氯化血根碱处理组(300,400,500nM)穿过transwell小室的细胞数量明显减少,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,穿过transwell小室的细胞数量逐渐减少。细胞侵袭实验结果与细胞迁移实验结果一致。10.不同浓度氯化血根碱(0,0.5,0.75,1μM处理NCI-H1688和NCI-H82细胞24小时,通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53表达水平,发现与对照组比较,氯化血根碱处理组(0.5,0.75,1μM)CDKN1A和CDKN1B基因mRNA表达水平上升,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,CDKN1A和CDKN1B的表达量也逐渐增加;而CDKN1C和P53的表达差异不明显。同时,与对照组比较,氯化血根碱处理组(0.5,0.75,1μM)CDKN1A蛋白表达也明显上调,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,CDKN1A的表达量也逐渐增加;CDKN1B蛋白表达量较对照组有所上调,但各浓度间差异不明显;CDKN1C和P53蛋白表达差异不明显。11.在裸鼠异种移植瘤模型中,发现氯化血根碱能够抑制裸鼠肿瘤的生长。同时,CDKN1A在氯化血根碱治疗组裸鼠移植瘤组织切片中的阳性细胞数明显增多。12.通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A的表达(包括mRNA和蛋白水平)明显低于正常细胞。同时,CDKN1A在小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌临床肿瘤组织样本中的表达均明显低于正常组织。并且,抑制CDKN1A的表达可以促进NCI-H1688细胞增殖和克隆形成。13.氯化血根碱与帕比司他联用具有高度协同作用,能够更好的抑制小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞生长和增殖。0.5μM氯化血根碱、60nM帕比司他及两者联合处理NCI-H1688细胞24小时,通过流式细胞术检测细胞周期分布情况,发现0.5μM氯化血根碱联合60nM帕比司他处理组G1期细胞比例最高。同时,0.5μM氯化血根碱联合60nM帕比司他处理组CDKN1A表达明显上调,而CDKN1B、CDKN1C和P53蛋白表达有所下降。结论:1.筛选得到39个化合物作为潜在的小细胞肺癌抑制物;氯化血根碱不仅能够抑制小细胞肺癌细胞增殖,并且对正常细胞的杀伤力小,是潜在的小细胞肺癌抑制物。2.miR-301a是一种致癌miRNA,氯化血根碱能够抑制miR-301a的表达并抑制BEAS-2B-As细胞增殖。SMAD4是miR-301a的靶基因,miR-301a和SMAD4在三氧化二砷诱导的癌变中,起着重要的作用。并且,激活STAT3/mmiR-301a/SMAD4在三氧化二砷诱导的人肺支气管上皮细胞转化过程中,起着关键的正向调节作用。3.氯化血根碱能够抑制小细胞肺癌细胞生长和增殖,能够抑制细胞周期、运动、迁移和侵袭,以及促进细胞凋亡。同时,氯化血根碱联合帕比司他能够增强抗小细胞肺癌的作用。并且,氯化血根碱通过上调CDKN1A的表达发挥抗小细胞肺癌的作用。