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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染猪或野猪引起的一种急性、致死性传染病。CSFV感染猪可引起高热、多器官的出血坏死性炎症及高致死率,对养猪业危害重大。尽管CSF的防控已经取得很大进展,CSFV的致病机制仍不清楚。内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）和自噬是真核细胞内蛋白质稳态和细胞代谢的重要调节机制。许多哺乳动物病毒在感染宿主细胞的过程中,可通过调控ERS和自噬来影响细胞的天然免疫、凋亡等过程,以维持病毒感染,而CSFV体内/外感染过程中ERS、自噬及病毒复制之间的关系仍未完全阐明。本论文结合体内/外研究,揭示了CSFV感染诱导的细胞ERS与自噬、病毒复制及天然免疫的关系,为进一步阐明CSFV致病机制提供了科学参考。CSFV感染猪组织病变、病毒载量与细胞ERS-自噬的关系研究。本研究首先通过测量猪体温变化、观察临床症状和病理学变化及检测CSFV感染情况,成功建立了CSFV体内感染猪模型。病理学研究表明,CSFV感染猪多器官发生不同程度的出血性、坏死性炎症,其中扁桃体、淋巴结、脾脏、胸腺、肾脏、肺脏和肠道的组织损伤程度明显高于心脏、肝脏和脑。组织病毒载量检测结果显示,CSFV感染猪扁桃体、淋巴结、脾脏、胸腺、肾脏、肺脏和肠道中CSFV NS5B基因拷贝数明显高于心脏、肝脏和脑,提示CSFV感染猪的组织病变程度与病毒载量的差异有关。Western blot检测结果发现,对于病理损伤程度和病毒载量较高的器官（扁桃体、淋巴结、脾脏、胸腺、肾脏、肺脏和肠道）,CSFV感染可诱导强烈ERS并激活3条未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）通路,包括PERK（Protein kinase R-like ER kinase）、IRE1（Inositol requiring enzyme 1）和ATF6（Activating transcription factor 6）,还可引起完全自噬;而病理损伤程度和病毒载量较低的器官（心脏、肝脏和脑）发生温和ERS且仅激活IRE1途径,同时未见明显自噬。综合分析以上结果我们推断,CSFV感染猪各器官的组织损伤、病毒载量差异可能与组织细胞ERS-自噬水平有关。CSFV感染诱导的细胞ERS与自噬的关系研究。为验证CSFV感染诱导的细胞ERS和自噬之间的关系,我们进一步开展了细胞实验研究。首先利用CSFV感染PK-15或3D4/2细胞,分别通过q RT-PCR和Western blot检测细胞ERS和自噬分子的表达。结果发现,CSFV感染可诱导细胞ERS并激活PERK和IRE1通路,还可诱导完全自噬。进一步研究发现,ERS激动剂（Thapsigargin/TG）预处理可显著提高CSFV感染细胞的自噬活性,而ERS抑制剂（TUDCA和4PBA）可显著降低CSFV感染细胞的自噬活性,且均具有一定的剂量依赖性,表明CSFV可通过细胞ERS介导自噬。进一步利用ERS调节剂处理PK-15细胞,然后依次进行自噬双荧光报告质粒（m RFP-GFP-LC3）转染和CSFV感染,通过激光共聚焦显微镜检查细胞中自噬体和自噬溶酶体的数量,以评估细胞自噬流量。结果显示,TG处理可明显增加CSFV感染细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量,提示自噬流量增大,而TUDCA和4PBA处理均可明显减少CSFV感染细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量,提示自噬流量减小;以上结果表明,CSFV感染细胞可诱导ERS介导的完全自噬。此外我们发现,TG处理可提高而TUDCA或4PBA处理可降低CSFV感染细胞中CSFV NS5B基因转录水平、病毒Npro蛋白表达量及病毒滴度,提示CSFV诱导的细胞ERS可以促进CSFV复制。自噬激活剂（Rapamycin/RAPA）可明显提高而自噬抑制剂（3-Methyladenine/3-MA）可明显降低CSFV感染细胞中NS5B基因拷贝数和病毒滴度,提示CSFV诱导的自噬有利于病毒复制。进一步利用TG或TUDCA预处理PK-15和3D4/2细胞,再利用RAPA或3-MA处理细胞,然后进行CSFV感染,分别利用q RT-PCR和TCID50方法测定细胞中CSFV NS5B基因的拷贝数和病毒滴度。结果发现,RAPA可促进CSFV在感染细胞中复制,TG可进一步增强而TUDCA可明显抑制RAPA对CSFV复制的促进作用;3-MA可抑制CSFV复制,TUDCA可进一步加剧而TG可明显逆转3-MA对CSFV复制的抑制作用。综合分析以上结果,CSFV体内/外感染可通过诱导ERS介导的自噬维持病毒复制。为揭示CSFV感染诱导ERS介导的自噬作用机制,我们分别利用PERK和IRE1通路调节剂或靶向PERK、IRE1和GRP78基因的小干扰RNA处理细胞,再进行CSFV感染,通过q RT-PCR、Western blot和TCID50分别检测细胞ERS、自噬和病毒基因的转录、翻译水平及病毒滴度。结果发现,PERK激动剂（CCT020312/CCT）、e IF2α去磷酸化抑制剂（Salubrinal/SAL）和GRP78激动剂（BIX）均可增强CSFV感染细胞的自噬活性和病毒复制;而PERK抑制剂（GSK2606414/GSK）、IRE1抑制剂（4μ8c）及PERK、IRE1和GRP78基因功能沉默的作用相反。结果表明,CSFV感染细胞可引起PERK和IRE1通路介导的自噬,促进病毒复制。进一步研究发现,CCT、SAL和BIX处理均可明显增大CSFV感染PK-15细胞的自噬流量;而GSK、4μ8c处理及PERK、IRE1和GRP78基因功能沉默的作用相反。结果表明,CSFV感染细胞可诱导PERK和IRE1通路介导的完全自噬,以促进CSFV复制。此外,我们还发现CCT、SAL和BIX均可显著提高CSFV感染细胞中IFN-γ和TNF-α基因的转录水平,而GSK、4μ8c处理及PERK、IRE1和GRP78基因功能沉默的作用相反。结果表明,CSFV感染细胞可能通过激活PERK和IRE1通路,增强IFN-γ和TNF-α基因的转录,进而参与细胞的免疫调节。ERS调节剂对CSF E2亚单位候选疫苗免疫效果的影响研究。鉴于ERS具备潜在的免疫调节特性,我们探索了ERS调节剂（TG、TUDCA和4PBA）与CSF E2亚单位候选疫苗联用对实验用新西兰兔免疫效果的影响。通过间接ELISA检测免疫兔血清中CSFV E2特异性抗体滴度;通过CCK8法和q RT-PCR法分别检测兔外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的增殖活性及其Th1型和Th2型细胞因子基因的转录水平;此外,还对免疫兔进行了定型热和组织病毒载量检测。结果显示,一方面,CSF E2亚单位候选疫苗免疫能刺激兔机体持续产生高效价的E2特异性抗体,同时增强免疫兔PBMC的增殖活性及其Th1型（IFN-γ、TNF-α、IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）基因的转录,表明该候选疫苗免疫能刺激兔机体产生有效的体液免疫和细胞免疫应答。空白组的兔在进行CSFV-C株攻毒后出现定型热,且兔脾脏、淋巴结及PBMC中CSFV NS5B基因的拷贝数均较高;而CSF E2亚单位候选疫苗免疫组和C株疫苗免疫组的兔在攻毒后均未出现定型热,且兔脾脏、淋巴结、肾脏和PBMC中均未检测到病毒基因的表达。结果表明,CSF E2亚单位候选疫苗免疫可为CSFV-C株攻毒兔提供完全保护。另一方面,ERS调节剂（TG、TUDCA和4PBA）对该候选疫苗刺激产生的体液免疫应答无影响,但能有效调节Th1型免疫应答,且不影响该候选疫苗的攻毒保护力。以上结果证实了CSF E2亚单位候选疫苗良好的免疫效果与ERS调节剂作为CSF免疫调节剂的潜力。综上,通过体内/外研究,我们发现CSFV感染细胞可诱导ERS发生,并激活PERK和IRE1通路介导的完全自噬,以促进CSFV复制;PERK和IRE1通路可能在细胞的免疫调节方面发挥重要作用。本研究为阐明CSFV致病机制与研发CSF防控的新策略奠定了基础。此外,我们还发现ERS调节剂可有效调节CSF E2亚单位候选疫苗免疫兔引起的细胞免疫应答,为筛选临床上CSF免疫调节制剂提供了参考。