目的及意义:骨性关节炎(OsteoarthritisOA)是一种关节软骨退变和关节周围形成骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病,是影响人类健康最常见的关节疾患之一,是导致50岁以上人群功能残疾、造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一。国内统计资料表明,我国患有OA的人数占总人口的3％,其中大部分为膝OA,55岁人群以上X线上有膝OA表现者约60％,65岁以上老年人X线上有膝OA的发病率可达85％,目前我国正在步入人口老龄化国家的行列,因而OA的发病率将有增无减,可见其影响巨大,正因为如此目前该病正成为大家关注的热点。骨关节炎的治疗目标是控制疼痛、改善关节功能和生活质量,抑制疾病的进程,尽可能避免治疗的毒副作用。西医学根据OA的发病机理,研究了许多新型药物及方法治疗OA,并取得显著进展,同时提出了今后研究策略。目前在OA的治疗方面对抑制整个疾病的进程的药物(如补充软骨基质成分的氨基葡萄糖、IL-1抑制剂双醋瑞因、有提高滑液质量并保护软骨的透明质酸)的研究较多,但是因为价格均较贵、起效也较慢而限制了它们的应用。中医学认为,骨性关节炎属于“痹证”、“骨痹”范畴。《素问·痹论》曰:“风寒湿三气杂至,合而为痹也。五脏皆有合,病久而不去者,内舍于其合也。故骨痹不已,复感于邪,内舍于肾。”风寒湿邪侵袭及跌仆扭伤为发病诱因,肝肾亏虚是本病发病基础,也是疾病继续发展的结果,故本病的治则:祛风散寒除湿止痛,补益肝肾。青风藤为防已科植物青藤的干燥根茎,苦、辛、平稍偏温。中医药学应用青风藤已有一千多年的历史效果显著。清风藤名称始见于宋-《图经本草》,苏颂颂曰:“生台州天台山中。其苗蔓延木上,四时常青。土人采茎用……,……治风疾。”具有祛风散寒除湿、通络止痛的作用。青风藤的主要药理成分为青藤碱,应用体外酶反应实验体系,观察青藤碱对离体环氧化酶-1(COX-1)和COX-2纯酶活性的影响,结果提示青藤碱选择性抑制COX-2活性,说明其具有较强的抗炎镇痛作用而且胃肠副作用小,因此青藤碱能迅速缓解类风湿性关节炎(RA)所致的疼痛。也有研究显示青风藤能显著增强小鼠非特异性免疫功能,抑制细胞免疫功能,但对体液免疫功能无明显影响。从细胞因子基因调控研究青藤碱抗炎抗风湿作用机制,发现青藤碱能通过下调人外周血单个核细胞IL-1β、IL-8mRNA表达发挥对关节炎的治疗作用,从而抑制RA曲发展进程。前对青藤碱的研究多集中在类风湿性关节炎上,使用方法多为口服或肌肉注射,而对于在OA中的治疗作用及作用机理的研究、以及对于软骨细胞组织学和超微结构的改变尚未见报道。本研究拟应用青藤碱注射液给予OA模型动物关节腔内注射,通过检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α变化,以及OA关节软骨组织学和超微结构的改变,探讨青藤碱治疗OA的可能机制,为临床应用青藤碱防治OA寻找和奠定理论基础。实验方法:本实验拟应用管型石膏固定制动方法对42只健康日本大耳白兔进行OA造模,将36只模型兔分为3组:青藤碱关节腔注射治疗组、透明质酸组即施沛特关节腔注射对照组、生理盐水关节腔注射组即模型组、另外4只健康兔作为正常对照组不给予任何处理。观察青藤碱关节腔注射对OA兔血清及关节滑液中细胞因子的影响以及对模型兔关节软骨组织学和超微结构的改变的影响,探讨青藤碱治疗OA的作用机制。具体方法如下:1、兔膝OA模型的建立:管型石膏固定兔左后肢关节,并在2、4、6周时用耳缘静脉空气栓塞法分别处死2只造模兔,观察兔膝关节外观及软骨大体解剖结构,通过肉眼观察及按关节镜下软骨破坏分期标准判断兔膝关节OA是否建立。2、细胞因子的检测:分别在1、2、3、4、5周各给予青藤碱、施沛特、生理盐水0．2 m l关节腔注射,在治疗前及治疗5周后分别抽取静脉血及膝关节滑液,作血清及膝关节滑液细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α检测(试剂由上海西唐公司提供,严格按照试剂盒上要求进行操作,IL-1β批号为0510132,IL-6批号为0510094,TNF-α批号为0510118)。3、通过肉眼大体评分对各组实验组兔关节软骨病变的变化进行观察比较;通过光镜对各组实验前后组织形态学与组化双染色(HE／safraninO双染色)进行观察并按照调整后的关节软骨病变的组织学-组织化学Mankin’s评分进行比较;透射电镜观察各组软骨结构超微结构变化,并对各组进行比较。结果:在成功建立兔膝OA模型的基础上,分别给予OA兔关节腔内注射青藤碱、透明质酸、生理盐水,发现青藤碱及透明质酸关节腔内注射前后血液及关节腔滑液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均有明显下降,治疗组与对照组相比差异有显著性。具体结果如下:1、兔膝OA模型的建立:健康日本大耳白兔管型石膏固定后,分别在2、4、6周时通过耳缘静脉注射空气法各处死2只兔,第2周时肉眼观察发现兔膝关节面欠光滑平整,关节间隙尚正常、对称、无软骨下骨硬化和骨赘形成;第4周时观察发现兔膝关节内侧关节间隙稍交窄,软骨下骨轻度硬化,密度稍增高,未见明显骨赘形成;第6周时拆除石膏可发现兔膝关节肿大变形,剖开膝关节可见典型OA表现,关节面不平整,内侧关节间隙狭窄,软骨小溃疡形成,软骨下骨较硬化,有少许骨赘形成,光镜组织形态学与组化染色观察以及透射电镜观察均符合OA的表现。2、实验前后细胞因子的变化:①青藤碱组关节腔内注射前后血液中及关节滑液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有明显变化,同组间相比差异有显著性(P<0．01=。②透明质酸组关节腔内注射前后血液中及关节滑液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有明显变化,同组间相比差异有显著性(P<0．0 5)。③生理盐水组关节腔内注射前后血液中及关节滑液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α无明显变化,同组问相比差异无显著性(P>0．0 5)。④青藤碱组与透明质酸组治疗后血液中及关节滑液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有明显变化,青藤碱组明显优于透明质酸组,两组间相比差异有显著性(P<0．0 5)⑤青藤碱组组及透明质酸组治疗后血液中及关节滑液中细胞因子的变化与生理盐水组相比均有明显变化,差异有显著性(P<0．01)。⑥青藤碱组、透明质酸组、生理盐水三组在治疗后和正常D组相比差异均有显著性(P值分别小于0．05、0．05、0．01)3、关节软骨结构组织形态学及超微结构变化:1)肉眼大体评分:①治疗组关节腔内注射后肉眼观察关节软骨病变的大体评分与生理盐水组相比有显著性差异(P<0．05)②对照组关节腔内注射肉眼观察关节软骨病变的大体评分与生理盐水组相比有显著性差异(P<0．05)③治疗组与对照组治疗后肉眼观察关节软骨病变的大体评分有明显变化,治疗组明显优对照组,两组间相比差异有显著性(P<0．05);④正常组与治疗组、对照组及模型组三组相比差异有显著性(P<0．05、P<0．05、P<0．01)。2)组织形态学与组化染色观察:治疗组关节软骨出现裂隙,可达切线层和过渡层,出现了细胞增生或轻度细胞克隆化形成的软骨细胞簇,有多重潮线,safraninO染色轻到中度的减少,与模型组相比Mankin’s评分有显著性差异。对照组关节软骨的裂隙深入放射层,有细胞克隆化形成的软骨细胞簇,或有细胞减少,有多重潮线和潮线被毛细血管穿破现象,safraninO染色中到重度的减少,与模型组相比Mankin’s评分有显著性差异;模型组关节软骨的裂隙可达钙化层,甚至结构被完全破坏,细胞减少,只残留无细胞的HE红染物质,软骨下骨增生,safraninO无染色,病变加重明显;正常组关节软骨表面大多完整,软骨略显苍白,稍软,镜下见关节软骨表面多光滑,细胞正常或有轻度增生,潮线多完整,safraninO染色均匀,与模型组相比Mankin’s评分有显著性差异。3)透射电镜观察:模型组呈颗粒状外观,交链现象不明显;细胞轮廓不清晰,胞核消失,细胞裂解为大量致密的颗粒状物,有向陷窝一角聚集的倾向。正常组交链较为紧密,可见周期性横纹;细胞呈梭形或椭圆形,胞核完整,核膜清晰,染色质分布均匀,胞浆密度均匀或轻度增加,部分出现空泡,可见内质网、线粒体等细胞器。对照组交链出现紊乱;细胞缩小,胞核变形,有分离现象;胞膜出现不连续现象,胞浆丢失严重,可见大量脂滴或囊泡;胞周出现较多致密颗粒。治疗组与治疗前相比无明显变化,介于对照组和正常组之间,交链出现轻度紊乱,细胞缩小,胞核变形,核膜不很清晰,胞浆开始丢失。研究结果表明,采用管形石膏制动的方法对健康、成年兔进行膝0A造模,6周后兔膝关节就出现中重度的退变,具有造模时间短,操作简单,可重复性强,动物死亡率低等特点,该方法没有使用任何药物也没有其他可能对实验有影响的因素,而且接近人类的发病过程,是一个比较好的0A的造摸方法。青藤碱关节腔内注射对OA兔血液、关节滑液中的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有抑制作用,并且能够抑制关节软骨的进一步退变,因此在一定程度上抑制了疾病的进一步进展。从而能够有效的治疗兔OA。