一、研究背景瘢痕疙瘩是一种持续生长并超出原皮肤创缘的病理性瘢痕,以成纤维细胞的不断增殖及细胞外基质特别是胶原的过度沉积为特征,被视为人类独有的真皮成纤维细胞肿瘤。瘢痕疙瘩不仅仅影响美观,而且常伴有痉痒和疼痛感等局部症状,甚至导致局部功能障碍,给患者的生理和精神上都带来了巨大的痛苦。瘢痕疙瘩成纤维细胞与其他正常成纤维细胞相比,其Ⅰ型胶原及纤维粘连蛋白过度表达以及胶原多肽的降解降低导致细胞外基质过度沉积；VEGF、TGF-β1、TGF-β2等生长因子及PDGF-α受体等生长因子受体的过度表达,同时瘢痕疙瘩成纤维细胞对生长因子的刺激反应敏感；瘢痕疙瘩成纤维细胞增生及凋亡失衡,瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的凋亡率要明显低于正常皮肤组织中,成纤维细胞。这些差异都是引起瘢痕疙瘩形成的重要原因。瘢痕疙瘩是整形科常见疾病,但也是临床工作所面临的治疗难点,现常采用手术切除、激光治疗、类固醇药物注射、硅凝胶治疗、放射治疗、5-氟尿嘧啶注射等治疗方法的综合运用,这些方法取得了一定的疗效,但也存在各自的不足,因此至今尚缺乏瘢痕疙瘩的理想治疗方法。现常用的瘢痕疙瘩治疗方法中,5-氟尿嘧啶注射治疗、激光治疗、皮质类固醇激素注射及射线治疗的治疗原理之一即是诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡,抑制其增殖。有研究者提出,现今瘢痕疙瘩治疗效果欠佳也与细胞凋亡有关,方面是人为诱导凋亡仍然不足,另一方面是可能是诱导凋亡过度,导致其他种类细胞死亡,引发新的修复后,而造成延迟性的增生。可见,寻找瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡缺陷机制以及有效诱导共凋亡对瘢痕疙瘩治疗具有重要意义。近年来,在中药或中药提取物治疗瘢痕疙瘩的研究方而取得了一定的进展。研究指出丹参与黄芪的混合提取物(CASE)可通过调节¨TGF-β/Smad通路,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭及胶原合成的作用,但CASE具体有效成分并不十分明确。CASE主要成分之一的丹参是具有很多药理作用的活血化瘀药,主要成份包括丹参酮(Ⅰ、ⅡA、ⅡB)、异丹参酮(Ⅰ、Ⅱ)等。其中,而丹参酮ⅡA是丹参中主要有效成分之一,其标准品稳定易得。丹参酮ⅡA含有酮型结构,易被氧化还原,可参与机体的多种生化反应而有多种生物活性。近来研究发现,丹参酮ⅡA可诱导多种人类肿瘤细胞的凋亡,可诱导白血病THP-1细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞以及人结肠癌细胞凋亡的作用。并且有报道指出,兔耳增生性瘢痕模型中,丹参酮ⅡA对兔耳增生性瘢痕有明显的抑制作用；丹参酮ⅡA具有抑制胆管来源成纤维细胞增殖及胶原的分泌,诱导MMP-9mRNA的表达而促进胶原降解,抑制胆道瘢痕的形成的作用。考虑丹参酮ⅡA可能对瘢痕疙瘩成纤维细胞也具有同样的抑制增殖,诱导凋亡的作用,可用于瘢痕疙瘩的治疗。由于瘢痕疙瘩是人类所特有的病理性瘢痕,至今尚无理想的瘢痕疙瘩动物模型,因而增加了瘢痕疙瘩的研究难度。现瘢痕疙瘩动物模型的建立主要有以下三种：①在动物身上诱导出类似瘢痕疙瘩的瘢痕增生模型；②将人的瘢痕疙瘩移植于免疫缺陷动物体内；③应用组织工程的原理和方法构建人瘢痕疙瘩动物模型。第一种动物模型的瘢痕增生程度和人体瘢痕差距明显,该模型仍存在很多争论,治疗评价研究所得结果可信度受到影响；第三种应用组织工程的原理和方法构建人瘢痕疙瘩动物模型的方法尚不十分成熟,相关文献报道不多,还需进一步研究探讨,第二种动物模型自1985年,Shetlar首次报道,随后Estrem及Kischer等人进行了类似的研究,证实了该动物模型的可行性。此后,我国学者在此基础上也开展了进一步的研究。他们研究发现,裸鼠瘢痕疙瘩模型中移植于裸鼠皮下的瘢痕疙瘩组织能基本保持原有的组织学形态和生物学形态,具有较好的可操作性和可复制性。并且在裸鼠的瘢痕疙瘩模型建立过程中,保留表皮的裸鼠瘢痕疙瘩模型更能维持瘢痕疙瘩原有的生物学特性。并有研究明确指出,瘢痕疙瘩组织植入后的1～4周是良好的实验干预时机,是一个相对理想的瘢痕疙瘩模型。二、研究目的本实验研究是体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞后,给予丹参酮ⅡA干预,并与对照组进行比较,观察体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞增殖,细胞凋亡及细胞周期的变化,探讨丹参酮ⅡA对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞的影响。将瘢痕疙瘩组织块植入裸鼠皮下,制作瘢痕疙瘩裸鼠模型,观察该动物模型的可靠性,并于裸鼠腹腔注射丹参酮ⅡA,与对照组进行比较,观察瘢痕疙瘩组织块的大体形态变化,组织学形态变化,特别是细胞凋亡情况。三、方法1.实验组织来源：所用瘢痕疙瘩组织均取自上海交通大学附属上海市第九人民医院整形外科的17例瘢痕疙瘩患者。术前患者符合瘢痕疙瘩的临床诊断标准,术后病理证实与临床诊断一致。且患者无长时间外用瘢痕防治药物史,不伴有肿瘤及其他严重疾病。2.体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,实验所用的细胞为第1-2代细胞。3.体外培养细胞干预实验分组：本部分实验采用析因设计分组,按照干预浓度分别为(Oug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml),于不同干预时间点进行观察细胞增殖,凋亡及周期情况变化,并以Oug/ml组作为对组进行比较。每组样本量3-4例。4.CCK-8比色法制作标准曲线,并测定瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖情况。5.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡情况,比较细胞早期凋亡率的差别。6.流式细胞术PI法DNA染色检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期情况,比较G0/G1期细胞比例的差别。7.瘢痕疙瘩裸鼠移植模型的制作:将手术切取的瘢痕疙瘩组织,无菌条件下制成保留表皮的组织块,大小均为8mm×5mm×5mm,植入裸鼠右侧肩胛皮下腔隙内。8.瘢痕疙瘩裸鼠模型干预实验分组及给药方法：15只裸鼠模型在瘢痕疙瘩组织块植入后第16天,从中随机抽取3只裸鼠,对植入的瘢痕疙瘩组织的进行大体形态观察及组织学观察,以明确瘢痕疙瘩组织块植入第16天后组织的血供及组织存活情况；另外12只随机分成2组,每组各6只。一组为实验组,腹腔注射丹参酮ⅡA5mg；一组为对照组,腹腔注射等量生理盐水,两组均连续注射14天后处死裸鼠,取出植入的瘢痕疙瘩组织,对植入的瘢痕疙瘩组织的进行大体形态观察及组织学观察。9.瘢痕疙瘩组织的大体形态观察,观察植入组织块表面的血管情况,有无组织的萎缩坏死,并测量组织块大小10.瘢痕疙瘩组织石蜡切片后HE染色和Masson三色法染色进行组织学观察11.瘢痕疙瘩组织冰冻切片后Tunel法凋亡细胞染色观察12.数据处理及统计学分析方法：用SPSS13.0进行统计学分析。数据用x±s表示。细胞增殖活性、细胞早期凋亡率和G0/G1期细胞比例的比较采用析因设计方差分析,两两比较采用LSD法；瘢痕疙瘩组织块体积大小的比较采用两独立样本t检验的方法,P<0.05为有统计学意义的标准。四、结果1.CCK-8比色法制作标准曲线,其决定系数R2=0.96,回归方程为Y=-359.51+15211.73X(Y为瘢痕疙瘩成纤维细胞数,X为测得的OD值)。对方程进行统计检验显示,该方程具有统计学意义。CCK-8比色法测得的OD值可以很好的反应实际细胞数量。丹参酮ⅡA干预的实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性受到不同程度的抑制,其中200μg/ml组抑制作用最为明显,干预72小时、96小时、120小时后,OD值均数分别为0.41±0.10、0.60±0.27、0.70±0.27；而同期对照组0ug/ml组的OD值均数分别为0.56±0.02、0.97±0.01、0.99±0.06,计算其增殖抑制率分别为100.00%、76.29%、71.72%。统计分析显示,干预浓度对细胞活性的影响具有统计学意义(F=781.91,P<0.001),干预时间对细胞活性的影响具有统计学意义(F=1068.62,P<0.001),干预浓度和干预时间的交互作用对细胞活性的影响也有统计学意义(F=159.04,P<0.001)2.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡显示,丹参酮ⅡA干预的实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的早期凋亡率明显增高,其中200ug/ml组早期凋亡率增高最为明显,干预120小时后,早期凋亡率均数达41.62±1.84%,同期对照组Oug/ml组的早期凋亡率为3.68±0.76%,早期凋亡增加百分比达1030.98%。统计分析显示干预浓度对早期凋亡率的影响具有统计学意义(F=654.17,P<0.001),干预时间对早期凋亡率的影响具有统计学意义(F=252.42,P<0.001),干预浓度和干预时间的交互作用对早期凋亡率的影响也有统计学意义(F=91.91,P<0.001)3.流式细胞术PI法DNA染色检测细胞细胞周期显示,丹参酮ⅡA干预的实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的GO/G1期比例均不同程度增加,其中200ug/ml组G0/G1期比例增加最为明显,干预120小时后,G0/G1期均值为94.16±1.10%,同期对照组0ug/ml组的G0/G1期比例均数为75.13±1.53%,计算G0/G1期增加百分比达25.33%。统计分析显示,干预浓度对G0/G1期比例的影响具有统计学意义(F=60.31,P<0.001),干预时间对G0/G1期比例的影响具有统计学意义(F=24.44,P<0.001),干预浓度和干预时间的交互作用对G0/G1期比例的影响也有统计学意义(F=13.01,P<0.001)4.瘢痕疙瘩组织大体形态观察发现,该动物模型未见排斥反应。实验组和对照组连续干预14天后,实验组瘢痕疙瘩组织块大小为364.33±50.17mm3,对照组瘢痕疙瘩组织块大小为392.33-32.26mm3,两独立样本t检验统计分析显示,实验组与对照组瘢痕疙瘩组织块大小差异无统计学意义。5.HE染色及Masson三色法染色瘢痕疙瘩组织的组织形态学观察发现,该动物模型中瘢痕疙瘩组织块移植后组织血供良好,无排斥反应,并能够基本保持原有的组织学形态和生物学形态。实验组与对照组瘢痕疙瘩组织块的HE染色及Masson三色法染色的组织形态学表现未发现明显的差异。6. Tunel法凋亡细胞染色发现,对照组瘢痕疙瘩组织块的表皮部位能见到少量的凋亡细胞,瘢痕疙瘩组织块内部则极少发现凋亡细胞；而实验组瘢痕疙瘩组织块表皮及组织块内部均能可见大量凋亡细胞。五、结论丹参酮ⅡA可抑制体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性,诱导其凋亡并阻滞细胞周期,且干预效果存在干预浓度依耐性及干预时间依耐性；保留表皮的瘢痕疙瘩组织块植入裸鼠右侧肩胛皮下的瘢痕疙瘩裸鼠模型,可以基本保持原有的组织学形态和生物学形态,是一个相对理想的瘢痕疙瘩动物模型；丹参酮ⅡA裸鼠腹腔注射后14天后,其皮下的瘢痕疙瘩大体形态和组织学观察未见明显改变,但可诱导瘢痕疙瘩组织内细胞大量凋亡。