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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一种定殖于猪上呼吸道的条件性致病菌,其感染引起的副猪嗜血杆菌病(也称革拉瑟氏病,Gl?sser’s disease)主要以多发性纤维素性浆膜炎和关节炎为特征,呈世界性分布。近年来,在PCV2、PRRSV、霉菌毒素等导致免疫抑制作用的“底色病”的影响下,副猪嗜血杆菌病的发病率和死亡率持续性上升,其流行呈上升趋势,危害日渐严重。随着抗生素的逐步禁用,疫苗接种和强化饲养管理将是今后预防和控制HPS感染的主要措施。由于HPS具有明显的地方性流行特征,且血清型复杂,不同血清型菌株间的交叉保护性较低,因此分离鉴定不同地区感染流行的HPS菌株,不仅有利于全面了解该病的流行病学特征,还可以为该病的疫苗研究提供合适的候选菌株。因此,本研究对2018～2019年来自贵州省部分区县送检的14份HPS阳性样品进行了HPS的分离与鉴定,并对分离鉴定纯化的菌株进行了部分生物学特性研究,旨在丰富贵州省HPS感染流行菌株的流行病学资料,为进一步开展HPS的病原学及疫苗研究奠定基础。相关研究内容如下:1.HPS的分离与鉴定实验首先对贵州省部分区县2018～2019年期间送检的124份样品(血液,鼻腔拭子,脾脏、肺脏等),经含5μg/m L NAD的TSA培养基增菌后,提取混合菌液核酸,应用HPS 16S r RNA特异性引物进行PCR扩增测序。结果显示,其中14份样品为HPS阳性(均为肺脏增菌菌液),其核苷酸相似性为98.1%～100%,且分属于5个不同的进化分支。阳性样品中与病毒混合感染的检测结果表明,HPS分别与PCV2、CSFV及PRRSV混合感染率均为42.9%;HPS与PCV2、CSFV、PRRSV三种病毒形成四重混合感染率为7.1%(1/14),HPS单一感染率仅为14.2%(2/14)。通过对阳性菌液挑取单菌落,多代分离纯化后,最终分离获得了3株HPS分离菌株。3株HPS菌株在TSA固体培养基和血液琼脂培养基上均呈表面光滑整齐的半透明针尖样菌落,革兰氏染色为革兰氏阴性杆菌,其中HPS/CN/Guizhou/426株和HPS/CN/Guizhou/478株均呈短杆状,HPS/CN/Guizhou/449株呈短杆状和长丝状,符合HPS的多形性特点。生化鉴定结果表明3株HPS菌株对甘露糖、甘露醇、木糖、尿素、覃糖等呈阴性反应,对蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、硝酸盐还原、新生霉素、乳糖等呈阳性反应,亦均符合HPS的生化反应特征。卫星试验结果表明,3株HPS分离菌株均可与金黄色葡萄球菌在血液琼脂培养基的卫星现象不明显。纯化后的3株HPS经16S r RNA特异性引物,再次PCR扩增测序,所得序列与之前相应序列的比对结果表明,其核苷酸相似性均为100%。2.HPS分离菌株的生物学特性研究为了解3株HPS分离纯化菌的生物学特性,实验分别对其进行了培养特性、NAD依耐性、血清型PCR鉴定及药物敏感性试验等主要生物学特性研究。研究结果显示,3株HPS菌株均具有严格的NAD依赖性,在胎牛血清含量均为5%时,NAD浓度小于16μg/m L时,TSB液体培基中菌液OD600nm值与NAD浓度呈正比。因此,实验确定的最佳NAD添加量为16μg/m L。3株HPS分离纯化菌株在SS培养基、LB固体培养基、TSA固体培养基(不含胎牛血清和NAD)、改良Y培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基及蔡氏琼脂培养基上均不生长,在分别含有16μg/m L NAD和5%胎牛血清的LB固体培养基以及TSA培养基上均生长,在无NAD的血平板上培养24 h后出现米白色针尖样小菌落。应用Howell和Jia的报道等报导的HPS血清型PCR鉴定引物,分别对3株HPS分离菌株进行血清型PCR鉴定,仅血清5型特异性引物扩增出了与预期大小相符的目的条带,表明3株HPS分离纯化菌株均为血清5型。3株HPS分离纯化菌株相关毒力基因检测结果显示,HPS/CN/Guizhou/XYPA/2018426菌株和HPS/CN/Guizhou/BJXXW/2018478菌株含毒力基因MPB,扩增出了与预期扩增条带大小相符的片段,HPS/CN/Guizhou/QNDS/2018449菌株含毒力基因E30。药敏试验结果显示3株HPS分离纯化菌株,均对恩诺沙星和氟苯尼考敏感,对环丙沙星、新霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺异恶唑、甲氧苄氨嘧啶、复方新诺明、克林霉素、奥格门汀、头孢他啶等抗生素均已耐药。