食管癌是消化道肿瘤中常见的恶性肿瘤,在全球范围内的肿瘤排名中,其发病率和死亡率分别位列第九位和第六位。我国是食管癌的高发地区,全球每年新发食管癌病例和死亡病例的一半以上发生在中国,其发病率和死亡率位于中国恶性肿瘤的第六位和第四位。它有两个主要亚型:食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),这两种亚型在流行病学和生物学上是不同的。尽管EAC在美国和欧洲多个国家更为常见,但ESCC是全球食管癌的主要组织学亚型,占食管癌的80%以上,我国90%以上的食管癌病例病理分型为鳞癌。食管癌治疗过程中,手术、放疗和化疗是三大常规的治疗手段,目前外科手术是早期食管癌的确切治疗方法。然而食管癌早诊早治情况并不令人满意,大多数患者在就诊时为中晚期手术无法切除,此时根治性放化疗是其标准治疗方案。尽管在食管癌根治性放化疗和新辅助/辅助治疗的临床试验中观察到一些有希望的结果,但该病的5年总生存率仍在15-25%之间,对放化疗尤其是放射治疗的抵抗是其主要原因之一。放射治疗通过放射线产生的电离辐射引起被照射细胞的DNA产生多种形式的损伤,DNA双链断裂(double strand break,DSB)是主要的也是最致命的损伤形式。化疗药物是通过干扰细胞增殖过程中活跃的DNA复制,基因转录,蛋.白质翻译、修饰或折叠或细胞骨架的形成等,选择性杀死增殖较为旺盛的肿瘤细胞。然而随着对治疗敏感的肿瘤细胞被杀伤后,对放化疗耐受的肿瘤细胞会继续存活并持续增殖导致肿瘤的复发。由于细胞中拥有高度保守的DNA损伤感应机制,对细胞毒性作用的应激调控机制非常复杂,目前对于放化疗耐受的机制仍不是十分清楚。因此,进一步了解影响肿瘤细胞对放化疗敏感性的分子机制,将有助于未来对患者实施个体化治疗提高其生存率。高通量转录组学研究表明70-90%的人类基因组序列都能得以转录,但是只有小于2%的基因组区域能够编码蛋白质,大部分的转录来源于成为非编码RNA(noncoding RNA)的基因区。作为非编码RNA中具有调控功能的两种主要类型,小 RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码 RNA(long non-coding RNA,LncRNA)之间相互作用和影响,其表达和功能异常直接参与多种类型肿瘤的发生和发展,影响患者的治疗预后。MicroRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的非编码RNA分子,通常通过与编码蛋白的mRNA3’-UTR(untranslated region,UTR)区发生序列特异性结合,继而引起mRNA降解或抑制其翻译,导致这些蛋白编码基因的表达下调。MiRNA参与了多条关键的信号传导途径,能改变肿瘤细胞的放化疗耐受性,被认为是很有前景的预测放化疗耐受性的分子标记。MiR-155-5p的异常表达在包括ESCC在内的多种血液恶性肿瘤和实体瘤中表现为一种致癌特征。它能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导上皮间质转化、侵袭和迁移、肿瘤转移和复发。然而,关于其失调在放射和化疗抵抗中作用的报道却相互矛盾。例如,干扰miR-155-5p后会导致人表皮样癌细胞和乳腺癌细胞对化疗药物和电离辐射产生耐受性,也有不同的报道显示沉默miR-155-5p却显著提高了化疗药物和放疗的敏感性。因此,miR-155-5p在放射抵抗和药物抵抗中的作用是有争议的,可能与肿瘤的类型有关。非编码RNA家族的另一个重要成员是长度超过200bp个核苷酸的长链非编码RNA(LncRNA)。长链非编码RNA与mRNA拥有类似的结构,大部分也有5’端帽子结构和3’端多聚腺苷酸尾巴,甚至也可以被剪接。长链非编码RNA H19是最早被发现的LncRNA之一,它能与miRNA和功能蛋白质相结合,调控下游基因的表达,并能通过影响Wnt/β-catenin和血管生成等信号通路的活性参与肿瘤的发生发展。表达失调的H19在膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤中起致癌或抑癌作用。据报道H19与食管癌细胞侵袭和转移有关,在肝癌细胞的放射/化疗耐药改变中起到一定作用,并与乳腺癌患者预后不良和促进干细胞特性等相关。鉴于目前对miR-155-5p和LncRNA H19与ESCC细胞放射耐受性之间的关系知之甚少,在此项目中,我们系统地在分子和细胞水平上分别阐明这两种类型非编码RNA和其下游基因在ESCC细胞放射耐受形成中的作用及机制。第一部分DNA甲基化调控的miR-155-5p通过下调MAP3K10影响食管鳞癌放化疗敏感性研究目的1.研究miR-155-5p在ESCC细胞中的表达水平与增殖、侵袭和迁移能力以及放化疗耐受性之间的关系,并初步探讨miR-155-5p介导ESCC细胞放射耐受中的DNA损伤修复机制。2.研究ESCC细胞miR-155-5p宿主基因上游CpG岛区域甲基化水平及其对miR-155-5p转录的调控。3.揭示ESCC细胞中miR-155-5p的下游靶基因在调控ESCC细胞增殖、侵袭、迁移能力和放化疗耐受性中的作用以及其激活的信号通路。研究方法通过TCGA数据库分析确立miR-155-5p在ESCC中的表达及与预后的相关性。通过RT-qPCR和平板克隆形成实验,分别检测六株ESCC细胞系中miR-155-5p的表达水平和放射耐受性。通过CCK-8实验检测细胞对化疗药物的敏感性和增殖能力,划痕愈合实验和transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。通过亚硫酸氢盐处理后PCR测序(bisulfite conversion sequencing,BSP)的方法检测miR-155-5p基因上游CpG岛中DNA甲基化的水平。通过western blot检测miR-155-5p下游基因和DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。通过mimic/antagomir,siRNA/过表达载体转染确立miR-155-5p及其下游靶基因MAP3K10对食管鳞癌细胞系放化疗敏感性、侵袭、转移和增殖的影响。双荧光素酶报告基因实验确立miR-155-5p对MAP3K10的直接靶向作用和二者对JNK信号通路的影响。研究结果1.TCGA分析发现miR-155-5p在食管鳞癌组织中高表达,高表达的患者总体生存率显著降低。2.MiR-155-5p在ESCC细胞系中差异表达,且与细胞对放射的耐受性正相关。使用mimic提高细胞中miR-155-5p的表达水平,细胞经射线处理后的存活率相较于对照组显著升高;反之使用antagomir 下调细胞中miR-155-5p的表达水平,细胞经射线处理后的存活率相较于对照组显著降低,说明miR-155-5p的表达可以增强ESCC细胞对于射线的耐受性。3.提高(或降低)miR-155-5p的水平后,辐射后细胞中γH2AX的蛋白水平随时间延长快速(或缓慢)下降,Ku80蛋白水平快速(或缓慢)上升,而不影响Rad51蛋白的水平,说明miR-155-5p通过上调Ku80激活非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)途径提高 DSB 修复速率。4.此外,mimic转染提高细胞中miR-155-5p表达后,促进了细胞对化疗药物的耐受性以及侵袭、迁移和增殖能力;而antagomir转染下调细胞中miR-155-5p表达后,抑制了细胞对化疗药物的耐受性以及侵袭、迁移和增殖能力。5.BSP检测miR-155-5p基因上游CpG岛的DNA甲基化状态,发现DNA甲基化水平与miR-155-5p的表达呈负相关。使用甲基化酶抑制剂5-aza-dC处理高甲基化的细胞后,细胞中的DNA甲基化水平降低,miR-155-5p的表达升高,证实了 miR-155-5p基因的转录受到了 DNA甲基化的负调控。6.通过生物信息学软件预测和Array芯片分析,我们筛选出MAP3K10是miR-155-5p的下游基因。进一步western blot实验显示,MAP3K10的表达水平与miR-155-5p负相关,双荧光素酶报告基因实验显示,miR-155-5p可以直接结合 MAP3K10 3’-UTR,证实了 MAP3K10 是 miR-155-5p 的靶基因。7.使用siRNA敲低MAP3K10后引起了和mimic转染类似的表型,使用过表达载体提高MAP3K10后引起了和拮抗剂转染类似的表型。抑制MAP3K10使细胞中JNK信号活性降低,过表达MAP3K10使JNK信号活性上调,说明miR-155-5p通过下调MAP3K10影响JNK信号通路的活性。结 论本研究表明受DNA甲基化负调控的miR-155-5p增强了 ESCC细胞对放射和化疗药物的抵抗,促进了细胞的增殖、迁移、侵袭和更高效的DNA损伤修复。MiR-155-5p通过靶向下调MAP3K10抑制JNK信号通路对ESCC细胞的放化疗耐受和增殖起到了积极的调控作用。本研究为ESCC个体化放化疗的疗效预测提供了一个新的分子指标。第二部分 敲低LncRNA H19上调miR-22靶向下调WNT1抑制食管鳞癌放射耐受性研究目的1.研究ESCC细胞经辐射后建立的放射耐受株的增殖、迁移能力和干细胞特性的改变。2.探讨LncRNAH19对ESCC细胞放射耐受性及其他细胞学行为的影响。3.揭示ESCC细胞放射耐受机制中LncRNAH19的下游基因及参与的信号通路。研究方法利用在线数据库starBase分析H19在食管鳞癌中的表达水平。Oncomine数据库用于进一步验证H19表达与患者年龄、性别和肿瘤分期之间的关系。利用KM plotter数据库分析ESCC患者的总生存率。用X射线反复照射建立ESCC耐受细胞系KYSE-150R。通过克隆存活分析检测细胞的放射耐受性。通过MTS分析获得光密度值来检测细胞的增殖能力,通过Transwell和成球实验分析细胞的迁移和干细胞特性。通过RT-qPCR检测细胞中H19、miR-22-3p和WNT1的表达水平,用siRNA转染敲低H19分析其表达水平与miR-22-3p和WNT1表达的关系。用双荧光素酶报告基因实验确立miR-22-3p对WNT1的直接靶向作用。通过western blot检测改变细胞中H19和miR-22-3p表达水平后WNT1及其下游因子β-catenin、Cyclin D1和C-Myc的蛋白水平。研究结果1.根据在线数据库starBase以及Oncomine和KM plotter数据库显示H19在ESCC组织中表达显著上调,且与患者预后不良相关。2.建立了放射耐受细胞系KYSE-150R。克隆存活分析显示KYSE-150的细胞存活率显著低于KYSE-150R细胞,MTS分析显示KYSE-150R细胞的增殖速率明显高于KYSE150细胞;Transwell和成球实验显示KYSE-150R细胞较KYSE150细胞的迁移能力提高,球体形成能力增强:KYSE-150R细胞的干细胞相关基因OCT4、SOX2和NANOG的表达水平显著增高。3.RT-qPCR显示H19在KYSE-150R细胞中较KYSE-150细胞中明显上调;在KYSE-150R细胞中敲低H19后,细胞对辐射的耐受性降低,增殖速率变慢、迁移能力减弱以及细胞成球能力降低;敲低H19后OCT4、SOX2和NANOG的表达水平降低。4.与KYSE-150细胞相比较,KYSE-150R细胞中miR-22-3p的表达下调,而WNT1表达上调;敲低KYSE-150R细胞中H19的表达,miR-22-3p的表达水平上调,WNT1的mRNA和蛋白水平下调,WNT1下游因子β-catenin、Cyclin D1和C-Myc的蛋白水平下降,Wnt通路的活性受到抑制。5.双荧光素酶报告基因实验显示miR-22-3p可以直接结合WNT1 3’-UTR;在KYSE-150R细胞中转染miR-22-3p后,相较于转染NC组WNT1的mRNA和蛋白水平显著下调,WNT1下游因子β-catenin、Cyclin D1和C-Myc蛋白水平下降,过表达miR-22-3p靶向下调WNT1的表达,抑制Wnt通路的活性。结 论本研究表明在辐射耐受细胞中,敲低LncRNAH19通过上调miR-22-3p的表达靶向下调WNT1,抑制Wnt通路的活性从而抑制ESCC细胞的放射耐受性、增殖、迁移和干细胞特性。本研究为抑制ESCC的放射耐受性在分子水平上提供了一个新的思路。