研究背景和目的:中国是乙型肝炎病毒感染的中度流行区,正常人群乙肝表面抗原阳性率约7.18%。广东省是乙肝感染的高度流行区,正常人群乙肝表面抗原阳性率约13.55%,居全国第二位。血液系统恶性肿瘤患者由于免疫功能低下、多次输血等原因更易感染乙型肝炎病毒,国内报道异基因造血干细胞移植患者乙肝表面抗原阳性率约6.6%-10%,显著高于欧美水平。乙肝病毒感染是造血干细胞移植后发生肝功能损害甚至肝衰竭的重要原因之一,乙肝表面抗原阳性患者在造血干细胞移植后容易发生乙肝病毒再激活,发生率约14%-50%,可引起不同程度的肝炎,重型肝炎死亡率约40%,严重影响移植患者的疗效和预后。血液病患者是免疫功能缺陷人群,隐匿性乙肝感染患者比例较高,其乙肝血清学标志为乙肝表面抗原阴性,单个或者多个抗体阳性,也可见乙肝病毒血清学标志物均阴性,这类患者肝脏细胞和外周血单个核细胞中持续存在低水平的乙肝病毒复制,在化疗和移植后也可出现乙肝病毒再激活,比例约为21%-67%,如何预防隐匿性乙肝感染患者在造血干细胞移植后发生乙肝病毒再激活目前仍缺乏统一标准。此外异基因造血干细胞移植供者中有相当比例乙肝表面抗原阳性乙肝患者,可能通过移植感染乙肝表面抗原阴性受者,资料显示如果缺乏抗乙肝病毒预防,受者的乙肝感染率达22-55.5%。部分移植前乙肝表面抗体阳性患者在移植后可能丢失乙肝表面抗体而新发乙肝病毒感染,这些是造血干细胞移植治疗中亟待解决的问题。国际上多个慢性乙型肝炎临床实践指南均推荐对乙肝感染的造血干细胞移植患者预防性抗乙肝病毒治疗,目的是降低乙肝病毒再激活和相关肝炎的发生率。拉米夫定(lamivudine,LAM)是首个应用于临床的核苷类药物,在慢性乙型肝炎治疗中能有效抑制乙肝病毒复制,改善患者肝脏功能,减少肝硬化和肝癌发生率,拉米夫定也最先用于预防化疗和造血干细胞移植后乙肝病毒再激活,临床研究显示可以降低约70%乙肝病毒再激活率,但亦在长期临床应用中暴露出较严重的耐药和停药后复发问题。恩替卡韦(entecavir,ETV)是新一代核苷(酸)类抗乙肝病毒药物,在慢性乙肝患者的治疗中显示出比拉米夫定更强的抗病毒活性和改善肝功能的能力,且耐药发生率低,目前临床上恩替卡韦预防异基因造血干细胞移植后乙肝病毒再激活的疗效和安全性的报道较少,更缺乏与拉米夫定的对比研究。核苷类抗乙肝病毒药物在临床应用中暴露出耐药性、依从性差、不能清除乙肝病毒、停药后易复发、长期治疗经济负担重等问题。一些研究者尝试对异基因造血干细胞移植患者接种乙肝疫苗以预防移植后乙肝感染,但存在无应答或者低应答,预防作用有限等缺点。有研究者使用乙肝表面抗原刺激的树突状细胞治疗慢性乙型肝炎患者,成功诱导HBeAg/HBeAb血清学转换和乙肝病毒DNA转阴,提示细胞过继免疫可以治疗乙型肝炎,近年来在肾脏、心脏、胰腺、肝脏等实体器官移植中也相继报道乙肝过继免疫现象,但上述细胞过继免疫疗法和实体器官移植中的乙肝过继免疫均不能清除受者的乙肝表面抗原,提示并不能彻底清除乙肝病毒感染。异基因造血干细胞移植是一种彻底的过继免疫重建,有可能利用供者来源的正常免疫细胞清除受者体内的乙肝病毒感染。Shouval等发现乙肝表面抗体阴性小鼠接受乙肝表面抗体阳性小鼠的骨髓移植后体内产生了保护水平的乙肝表面抗体。Ilan等回顾性研究发现12例乙肝血清标记物阴性受者接受HBsAb+/HBcAb+供者的骨髓移植后体内平均乙肝表面抗体滴度达到了 155 土33mIU/ml,在随后的前瞻性研究中发现35例移植前乙肝血清标记物阴性受者接受HBsAb性供者骨髓移植后,22例受者移植后HBsAb转为阳性。以上研究表明异基因造血干细胞移植中供者针对乙肝的免疫力可以通过移植过继给受者,使受者在移植后获得乙肝特异性免疫。本研究分析异基因造血干细胞移植患者乙肝血清学标志物、乙肝病毒DNA和肝脏生化指标在移植前后的变化,及其与供者乙肝血清学标志物之间的关系,分析异基因造血干细胞移植中乙肝过继免疫的临床特点。本研究进一步分析接受拉米夫定或恩替卡韦治疗的乙肝表面抗原阳性的异基因造血干细胞移植患者的临床资料,比较拉米夫定和恩替卡韦预防移植后乙肝病毒再激活的疗效,分析乙肝过继免疫与核苷类药物在防治造血干细胞移植患者乙肝感染中的协同作用。对象和方法:1、异基因造血干细胞移植中乙肝过继免疫的临床特点研究:回顾性分析2006年1月至2015年3月南方医科大学南方医院,福建医科大学附属协和医院,福建省立医院多中心351例异基因造血干细胞移植患者的临床资料。患者年龄大于14岁,有完整的移植术前和术后的乙肝血清学标志物,乙肝病毒DNA,肝脏生化指标随访资料,其供者有完整的造血干细胞移植术前上述检验资料。排除供者和(或)受者合并甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、梅毒及人类免疫缺陷病毒感染的患者。分析受者移植后乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗体(抗-HBe)、乙肝核心抗体(抗-HBc);乙肝病毒DNA;肝脏生化指标包括丙氨酸转氨酶,天冬氨酸转氨酶,总胆红素和间接胆红素指标的变化,及其与供者乙肝血清学标志物之间的关系,分析受者移植后乙肝血清学标志物变化的相关危险因素。2、拉米夫定与恩替卡韦预防异基因造血干细胞移植术后乙肝病毒再激活的临床研究:回顾性分析2006年1月至2015年3月南方医科大学南方医院,福建医科大学附属协和医院,福建省立医院多中心234例异基因造血干细胞移植患者的临床资料。患者移植前乙肝表面抗原阳性并接受拉米夫定或恩替卡韦抗乙肝病毒治疗,有完整的移植术前和术后的乙肝血清学,乙肝病毒DNA,肝脏生化指标随访资料。排除供者和(或)受者合并甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、梅毒及人类免疫缺陷病毒感染;既往使用过其他抗乙肝病毒药物如阿德福韦酯、干扰素、乙肝病毒免疫球蛋白治疗;服药依从性差的患者。拉米夫定口服100 mg/d,恩替卡韦口服0.5 mg/d。至少移植治疗前一个月开始用药,至移植治疗结束并停用免疫抑制剂6个月以上,且复查乙肝病毒DNA持续阴性和患者肝功能正常后停药。分析拉米夫定或恩替卡韦治疗的患者在移植后乙肝病毒学应答、乙肝表面抗原清除、乙肝病毒再激活、乙肝病毒再激活肝炎的临床特点,并分析乙肝病毒再激活及相关肝炎的危险因素。统计学分析:所有数据使用SPSS 16.0软件(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计分析,计数资料比较采用x2检验,正态分布的计量资料比较采用独立样本t检验或方差分析。主要观察事件的累积发生率采用Kaplan-Meier曲线分析,组间差异比较用Log-rank检验。通过单变量和多变量Cox回归模型分析乙肝病毒再激活和相关肝炎的危险因素,多变量筛选采用逐步后退法,P>0.05作为剔除模型中不显著因子的标准。双尾P值<0.05表明差异有统计学意义。结果:1、异基因造血干细胞移植中乙肝过继免疫的临床特点研究:(1)患者一般资料和分组:351例异基因造血干细胞移植患者纳入本研究,男209例、女142例,中位年龄28(14-61)岁,中位随访时间19(5-36)个月。基础疾病主要包括急性淋巴细胞白血病120例、急性髓系白血病169例、再生障碍性贫血12例、慢性粒细胞白血病29例、骨髓增生异常综合征13例、非霍奇金恶性淋巴瘤8例。移植前286例患者处于原发病完全缓解状态,65例处于未完全缓解状态。280例接受亲缘供者移植,71例接受无关供者移植。移植方式主要为外周血干细胞移植273例、骨髓移植9例、外周血干细胞联合骨髓移植69例。入组患者根据供受者移植前乙肝血清学配对情况分为6组,分别为组1(供者 HBsAb-,受者 HBsAb-)16 例,组 2(供者 HBsAb-,受者 HBsAb+)31 例,组3(供者 HBsAb+,受者 HBsAb-)33 例,组 4(供者 HBsAb+,受者 HBsAb+)158例,组5(供者HBsAb+,受者HBsAg+)82例,组6(供者HBsAb-,受者HBsAg+)31例。(2)乙肝过继免疫对异基因造血干细胞移植受者获得乙肝表面抗体的影响:第3组33例HBsAb-受者接受HBsAb+供者移植后,20例(60.6%)患者HBsAb转阳,中位发生时间在移植后2(1.5-4)个月,血清HBsAb滴度105.76±17.45 mIU/ml,其余13例(39.4%)受者移植后HBsAb仍为阴性。第1组16例HBsAb-受者接受HBsAb-供者移植后无一例发生HBsAb转阳,两组差异具有统计学意义(P＜0.001)。表明HBsAb-受者接受HBsAb+供者移植后可以发生过继免疫获得乙肝表面抗体。此后第3组HBsAb转阳的20例患者中4例HBsAb又转阴,中位发生时间在移植后9(6-12)个月,其余患者移植后HBV免疫标记未发生变化。移植后HBsAb维持阴性的33例受者,10例(30.3%)发生HBsAg转阳和乙肝病毒DNA转阳,中位发生时间在移植后14(6-23)个月。移植后获得HBsAb并维持阳性的16例患者中位随访18(12-25)个月无一例发生HBsAg转阳和乙肝病毒DNA转阳(P<0.001),表明过继免疫获得的乙肝抗体能有效预防受者移植后发生乙肝感染。多因素Cox回归分析显示供者乙型肝炎表面抗体(阳性vs阴性)(HR=12.11,95%CI=3.23-42.37,P<0.001)是受者移植后获得乙肝表面抗体的唯一影响因素。(3)乙肝过继免疫对异基因造血干细胞移植受者丢失乙肝抗体的影响:第2组31例HBsAb+受者接受HBsAb-供者移植后,19例(61.3%)患者HBsAb转阴,中位发生时间在移植后12(8-16)个月,其余12例(38.7%)受者移植后中位随访19(14-30)个月仍维持HBsAb为阳性,平均HBsAb滴度50.95±10.51 mIU/ml。第4组158例HBsAb+受者接受HBsAb+供者移植后,29例(18.4%)受者移植后HBsAb转阴,中位发生时间在移植后12(8-18)个月,其余129例(81.6%)受者移植后中位随访20(9-36)个月仍维持HBsAb为阳性,平均HBsAb滴度155.33±31.3 mIU/ml。两组乙肝表面抗体丢失率差异具有统计学意义(P<0.001)。表明接受HBsAb+供者移植可以发生乙肝过继免疫,减少移植前HBsAb+受者在移植后发生的抗体丢失两组移植后HBsAb丢失的48例受者,5例(10.4%)发生HBsAg转阳和HBV-DNA转阳,中位发生时间在移植后14(10-19)个月,提示发生乙肝病毒感染或者乙肝病毒再激活,移植后维持HBsAb性的141例受者中位随访20(9-36)个月无一例发生乙肝病毒感染(P<0.001),表明移植后维持乙肝表面抗体阳性的受者对乙肝感染具有较强的的免疫力。单因素Cox回归分析显示供者乙型肝炎表面抗体(阳性 vs 阴性)(HR=0.02,95%CI=0.01-0.68,P<0.001)、受者移植前乙肝表面抗体滴度(高 vs 低)(HR=0.04,95%CI=0.01-0.87,P＜0.001)是受者移植后丢失乙肝表面抗体的影响因素。多因素Cox回归分析显示供者乙型肝炎表面抗体(阳性 vs 阴性)(HR=0.07,95%CI=0.02-1.13,P<0.001)和受者移植前乙肝表面抗体滴度(高vs低)(HR=0.11,95%CI=0.04-1.25,P<0.001)是受者移植后丢失乙肝表面抗体的主要影响因素。(4)乙肝过继免疫对异基因造血干细胞移植受者发生乙肝表面抗原清除的影响:第5组中16(19.5%)例HBsAg+受者移植后HBsAg转阴,中位发生时间在移植后2.5(1.5-3)个月,16例HBsAg转阴的受者发生轻型肝炎,ALT平均值为 115.04±17.12 IU/L,HBsAb 平均滴度为 114.39±14.35 mIU/ml。进一步分析数据显示,16例HBsAg转阴受者的供者乙肝血清学标志均为HBsAb+/HBcAb+,供者乙肝血清学标志为HBsAb+/HBcAb+的23例受者中有16例(69.6%)发生HBsAg转阴,但供者为单纯HBsAb+的59例受者中无一例在移植后发生HBsAg转阴,差异具有统计学意义(P<0.001)。第6组31例受者接受乙肝表面抗体阴性供者移植后也无一例发生HBsAg转阴。表明接受HBsAb+/HBcAb+供者移植产生的乙肝过继免疫可以清除部分HBsAg+受者的乙肝表面抗原,清除了受者的乙肝病毒感染。中位随访24(16-24)个月,发生HBsAg+清除的16例受者均维持HBsAg阴性和乙肝病毒DNA阴性,无一例发生乙肝病毒再激活。未发生HBsAg+清除的97例乙肝受者中15(15.5%)例在随访中发生了乙肝病毒再激活,中位发生时间在移植后15(4-23)个月。表明乙肝过继免疫清除受者乙肝病毒感染后可以有效预防受者移植后发生乙肝病毒再激活。多因素Cox回归分析显示供者乙肝血清学标志是否为 HBsAb+和 HBcAb+(是 vs 否)(HR=6.75,95%CI=2.57-18.35,P<0.001)是受者移植后发生乙肝表面抗原清除的唯一影响因素。2、拉米夫定与恩替卡韦预防乙肝病毒再激活的疗效比较(1)患者一般资料和分组:234例接受拉米夫定或者恩替卡韦预防性抗乙肝病毒治疗的HBsAg 阳性异基因造血干细胞移植患者纳入本研究,拉米夫定组119例,男71例、女48例,中位年龄27(18-58)岁。基础疾病主要包括急性淋巴细胞白血病41例、急性髓系白血病54例、再生障碍性贫血4例、慢性粒细胞白血病12例、骨髓增生异常综合征4例、非霍奇金恶性淋巴瘤4例,移植方式为外周血干细胞移植93例、骨髓移植3例、外周血干细胞联合骨髓移植23例。恩替卡韦组115例,男70例、女45例,中位年龄28(14-62)岁。基础疾病主要包括急性淋巴细胞性白血病42例、急性髓系白血病57例、再生障碍性贫血3例、慢性粒细胞白血病9例、骨髓增生异常综合征2例、非霍奇金恶性淋巴瘤2例,移植方式为外周血干细胞移植90例、骨髓移植2例、外周血干细胞联合骨髓移植23例。两组患者的基本临床资料无统计学差异(P均>0.05),具有可比性。(2)病毒学应答和乙肝表面抗原清除:恩替卡韦组47例基线乙肝病毒DNA拷贝数≥105copies/ml的患者从开始抗病毒治疗到完全病毒学应答(拷贝数<105copies/ml)中位时间为2(1-4)个月,拉米夫定组48例基线乙肝病毒DNA拷贝数≥105copieS/ml患者中位治疗时间为3(2-4)个月,差异有统计学意义(P=0.018)。拉米夫定组16例(13.4%)受者和恩替卡韦组14例(12.2%)发生乙肝表面抗原转阴,中位发生时间在移植后2.5(1.5-3)个月,两组HBsAg清除率和发生时间无明显统计学差异(P均>0.05),发生乙肝表面抗原转阴的受者的供者乙肝血清学标志均为HBsAb+/HBcAb+,移植后HBsAg转阴的30例患者中位随访24(16-24)个月均维持HBsAg阴性和乙肝病毒DNA阴性,无一例发生乙肝病毒再激活。(3)乙肝病毒再激活:移植后中位随访24(4-24)个月,拉米夫定组28例(23.5%)患者发生乙肝病毒再激活,恩替卡韦组2例(1.7%)患者发生乙肝病毒再激活,差异有统计学意义(P<0.001)。拉米夫定组发生乙肝病毒再激活的中位时间为17(3-23)个月,恩替卡韦组为18(18-21)个月。拉米夫定组28例乙肝病毒再激活患者中23例(82.1%)和恩替卡韦组2例乙肝病毒再激活患者中1例(50.0%)基线乙肝病毒DNA≥105copies/ml。拉米夫定组异基因造血干细胞移植后6、12、24个月乙肝病毒再激活的累积发生率为3.0%、7.0%、24.0%;恩替卡韦组为0%、0%、2.0%(P<0.001)。拉米夫定组28例和恩替卡韦组2例乙肝病毒再激活患者均进行了乙肝病毒耐药基因突变检测,拉米夫定组25例(21.0%)患者和恩替卡韦组1例(1.0%)患者检出乙肝病毒耐药基因突变。通过检测抗乙肝病毒治疗前冷冻的血清样品,拉米夫定组5例(4.2%)患者检出原发性耐药突变。(4)乙肝病毒再激活肝炎:拉米夫定组发生乙肝病毒再激活的28例患者中18例(64.3%)发生不同程度肝炎,包括13例(46.5%)轻中型肝炎和5例(17.9%)重型肝炎,轻中型肝炎的中位发生时间为移植后19(7-23)个月,重型肝炎中位发生时间为移植后5(3-9)个月(P<0.05)。恩替卡韦组2例乙肝病毒再激活患者中1例在移植后18个月发生轻型乙肝再激活肝炎。拉米夫定组在移植后6、12、24个月乙肝病毒再激活肝炎的累积发生率为3.0%、7.0%、15.0%;恩替卡韦组为0%、0%、1%(P<0.001)。拉米夫定组在移植后6、12、24个月发生重型乙肝再激活肝炎的累积发生率为3.0%、3.0%、4.0%;恩替卡韦组为0%、0%、0%(P<0.001)。拉米夫定组5例发生重型乙肝再激活肝炎患者中4例(80%)死于重型肝炎继发的多器官功能衰竭(multiple organ failure,M0F),13例轻中型乙肝再激活肝炎患者经更换恩替卡韦lmg/d治疗后肝功能恢复正常,乙肝病毒DNA转阴。恩替卡韦组1例轻型乙肝再激活肝炎经保肝支持等治疗后恢复。(5)乙肝病毒再激活及相关肝炎的危险因素分析:采用Cox比例风险模型对可能影响乙肝病毒再激活和相关肝炎的因素进行单变量和多变量回归分析,多因素分析结果显示抗乙肝病毒药物选择(HR=16.91,95%CI=8.25-52.23,P<0.001)和受者基线乙肝病毒 DNA 高低(HR=4.30,95%CI=2.23-11.58,P＜0.001)是乙肝病毒再激活的主要影响因素。而抗乙肝病毒药物选择(HR=6.40,95%CI=3.25-14.12,P＜0.001)是乙肝病毒再激活肝炎的主要影响因素。拉米夫定组和恩替卡韦组发生率大于5%的药物不良反应(adverse drug reaction,ADR)有疲劳、腹痛、腹泻、头晕,两种药物的常见不良反应比例没有统计学差异(P＞0.05),无3-4级药物相关的血液毒性和肾毒性。结论:1.异基因造血干细胞移植中存在乙肝过继免疫现象,与实体器官移植不同,是一种彻底的乙肝过继免疫重建。乙肝过继免疫可以将供者对乙肝病毒的正常免疫力通过造血干细胞移植过继给受者,使移植前缺乏乙肝表面抗体的受者在移植后获得抗体,对预防隐匿性乙肝病毒感染再激活有重要意义2.乙肝过继免疫还能减少移植前有乙肝表面抗体的受者在移植后丢失抗体,有效预防受者移植后发生乙肝病毒感染和再激活。3.更重要的是异基因造血干细胞移植的乙肝过继免疫能清除部分乙肝患者的乙肝表面抗原,并与核苷类抗乙肝病毒药物发挥协同作用,持久维持乙肝表面抗原阴性和乙肝病毒DNA阴性,有效预防了乙肝病毒再激活并能减少乙肝相关远期并发症的发生,意味着治愈了乙肝病毒感染。4.恩替卡韦能显著降低乙肝患者异基因造血干细胞移植后乙肝病毒再激活率和重症肝炎发生率,疗效优于拉米夫定,恩替卡韦还显示出更强的抗病毒活性和更低的耐药发生率。恩替卡韦和拉米夫定能与乙肝过继免疫发挥协同作用,持久维持乙肝表面抗原阴性和乙肝病毒DNA阴性,但两种药物对清除乙肝表面抗原的作用并无差异,这一过程中乙肝过继免疫可能发挥更重要的作用。5.我们的研究结果提示,利用异基因造血干细胞移植中的乙肝过继免疫联合核苷类抗乙肝病毒药物预防和治疗移植患者的乙肝病毒感染是非常有应用前景的新方法。