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第一部分RIP1、RIP3介导的程序性坏死在在大鼠髁突软骨细胞中的研究[目的]研究药物诱导的原代大鼠髁突软骨细胞程序性坏死的发生及其分子机制,以及Nec-1对其的保护作用。[方法]选取3周龄的SD大鼠,取颞下颌关节髁突软骨进行原代培养。用TNF-a(10ng/L)和放线菌酮(0.2mM)处理大鼠髁突软骨细胞以诱导其发生程序性坏死,再联合使用Nec-1和(或)Z-VAD-FMK。采用光学显微镜观察细胞大小、形态的变化;采用细胞活力检测试剂盒检查细胞活力改变;运用流式细胞仪技术检测细胞凋亡与坏死率;采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化,用ROS试剂盒检测细胞ROS含量;再用qRT-PCR检测细胞RIP1、RIP3和caspase8表达水平的变化。[结果]与对照组相比,TNF-a和放线菌酮单独作用大鼠髁突软骨细胞未见明显变化,但其联合作用可以诱导细胞死亡,线粒体膜电位亦发生改变,细胞ROS含量也升高,RIP1、RIP3和caspase8的表达也升高,而使用Z-VAD-FMK联合处理后,细胞死亡未见明显减少,再联合Nec-1处理后,细胞死亡现象得到明显缓解,线粒体膜电位也得到恢复,ROS含量降低,且程序性坏死相关因子RIP1和RIP3含量也降低。[结论]TNF-a、CHX和Z-VAD-FMK联合刺激原代大鼠髁突软骨细胞可以诱导其发生RIP1、RIP3依赖的程序性坏死,Nec-1可以抑制该效应。第二部分压力诱导的髁突软骨OA样病变过程中程序性坏死的发生及其作用机制研究[目的]颞下颌关节作为人体唯一的联动关节处于复杂的力学环境中,适度的力对维持关节内环境的稳态至关重要,但超过生理刺激的压力会造成其骨关节样病理破坏和软骨的退行性改变,如髁突软骨变薄、软骨基质降解和髁突细胞死亡等现象,但其病因和发病机理尚不清楚。本研究的目的是探究新近发现的细胞死亡模式——程序性坏死是否参与该过程,以及其具体分子机制和病理意义,为防治异常机械力导致的颞下颌关节疾病提供新的思路和科学依据。[方法]采用6周龄雄性SD大鼠,按照课题组自主设计的大鼠颞下颌关节压应力加载动物模型装置(专利号:201120210396.4),对加力组大鼠髁突软骨施加向上、向后的压应力(80g),加力时间设3天和7天两个时间,非加力组大鼠进行同样的操作但不实施实质性的压应力加载;再联合使用程序性坏死抑制剂necrostatin-1(Nec-1)和(或)van-caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK。采用苏木素-伊红(HE)染色观察加力及加药后大鼠髁突软骨厚度及形态学的变化;透射电镜观察大鼠髁突软骨细胞凋亡和坏死的发生;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测炎症相关因子 TNF-a、IL-1 和 MAC-1 以及程序性坏死标志因子RIP1、RIP3和凋亡标志分子Caspase-8的表达改变。[结果]1、HE染色结果显示与对照组相比,单纯药物处理后髁突软骨厚度未见明显变化,但压力加载后大鼠髁突软骨厚度变薄,随时间的延长,程度增加。对加力组进行药物处理后能缓解变薄,Nec-1效果较Z-VAD-FMK更显著。2、透射电镜观察到加力后髁突软骨细胞出现大量死亡,髁突软骨细胞出现细胞器肿胀、破裂等变化,细胞坏死较凋亡更多,药物处理后能缓解部分死亡。3、qRT-PCR结果和IHC结果显示压应力加载早期大鼠髁突软骨细胞TNF-a、IL-1β、MAC-1、RIP1、RIP3和caspase8的表达明显升高。而当关节腔注射Nec-1或Z-VAD-FMK后,可以抑制上述情况的发生,且联合作用组要依次优于Nec-1组和Z-VAD-FMK组。而应力加载后期上述蛋白未见明显高表达,单纯加药组与空白对照在上述各项中亦无显著差异。[结论]RIP1和RIP3介导的程序性坏死在压应力导致的大鼠髁突软骨变薄的病理变化过程起着重要作用,程序性坏死特异性抑制剂Nec-1可以缓解大鼠髁突软骨的变薄效应,抑制大鼠髁突软骨细胞死亡,可以通过降低大鼠髁突细胞内程序性坏死标志分子的表达来减少细胞的坏死,从而减少相关的炎症反应,对大鼠髁突软骨起着保护作用。本研究为从抑制软骨细胞发生程序性坏死来防治颞下颌关节骨关节炎提供了理论基础。