目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明,先天和后天多种因素导致的慢性炎性自身免疫疾病。以累及周身关节的局部损伤、滑膜炎为主要特征,目前还无法根治。多种炎性细胞及促炎因子参与该病的发生和发展,越来越多的研究显示,血小板除了作为传统意义上的止血卫士外,血小板异常活化在炎症和免疫应答过程中也起着非常重要的调节作用。既往国内外研究中发现RA发病中有血小板过度活化表现,但是,独立的血小板势单力薄,很难发挥强大的致炎功能,但是在与白细胞结合后,二者发生粘附聚集,导致表面以及内部的多种分子被激活并发生构象改变,由此循环往复产生的炎症效应被放大,并且互相影响互相活化。单核细胞作为机体重要的天然免疫细胞群,集吞噬、抗原提呈、分泌细胞因子等功能于一身,是其它类型细胞所不能比拟的。正因为如此,单核细胞影响着免疫和炎症反应的各个方面,同时在许多疾病的病原学及发病机制,特别是在RA发病中,起着重要的作用。最近,国际免疫学会联盟命名委员会将单核细胞分为CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++三个亚群,新命名分类的这三群细胞在RA体内的分布情况以及活化的血小板与单核细胞的黏附、聚集对单核细胞亚群的分化是否存在影响尚不十分清楚。因此,本课题测定了RA患者外周血血小板的活化及其与单核细胞的聚集情况,单核细胞亚群的比例和分布以及血小板对单核细胞活化和表型调控的作用。深入研究血小板在风湿免疫性疾病发病中的作用,探索该类疾病早期诊断及预后的新指标,为临床治疗提供理论依据和治疗靶点。方法:1.类风湿关节炎患者血小板的活化以及CD147的表达收集本院住院RA患者(均符合美国风湿病学会1987年RA分类诊断标准)外周静脉抗凝血,将40例RA患者分为30例活动组及10例非活动组,另设10例健康对照分别以Percp标记的抗CD61单克隆抗体,FITC标记的抗PAC-1、抗CD147单克隆抗体,PE标记的抗CD40L、CD62P单克隆抗体,采用流式细胞技术检测RA患者及健康人的血小板表面CD61设门、PAC-1、CD62P、CD40L和CD147表达的阳性率,分析类风湿关节炎患者血小板表面PAC-1、CD62P、CD40L和CD147的表达阳性率与炎症活动指标的相关性。2.RA外周血中单核细胞亚群的比例、CD147分子和胞内因子的表达采用PE标记的抗CD14抗体、PE-cy5标记的CD16抗体、APC标记的CCR2抗体染色,以流式细胞术检测RA患者外周血单核细胞亚群分布的比例,观察单核细胞(Mon)3个亚群:CD14+CD16-CCR2+(Mon1),CD14+CD16+CCR2+(Mon2)和CD14+CD16+CCR2-(Mon3)的比例以、膜表面CD147分子的表达和各个亚群细胞内TNF-a和IL-6的表达。3.血小板与单核细胞在RA外周血中的聚集情况采用四种流式表面抗体PE标记的抗CD14抗体、PE-cy5标记的抗CD16抗体、APC标记的抗CCR2抗体,FITC标记的抗CD42a抗体对外周血进行染色,采用流式细胞术检测RA患者外周血血小板与单核细胞的聚集(MPA:CD14+CD42a+);采用流式细胞术检测RA患者血小板与单核细胞三个亚群的聚集(CD14+CD16-CCR2+CD42a+,CD14+CD16+CCR2+CD42+和CD14+CD16+CCR2-CD42a+)。4.活化血小板对单核细胞亚群的作用分离健康人外周血单核细胞以及RA患者的血小板进行分组共培养。采用流式细胞术表面及胞内因子染色以及明胶酶谱法观察活化血小板对单核细胞亚群的比例、增殖、胞内促炎因子的分泌变化和MMP的表达;其次,通过检测单核细胞不同亚群Ikkβ的表达以及使用CD147m Ab、Ikk抑制剂阻断血小板与单核细胞的作用观察CD147是否参与其中,同时血小板与单核细胞间的相互作用是否可以通过阻断CD147对NF-κB信号通路的活化实现。分离健康人外周血中的单个核细胞(PBMC)并用流式细胞仪分选CD14+的单核细胞。分离活动期RA患者外周血中的洗涤血小板。将分选后的单核细胞与RA患者的血小板进行分组共培养48小时后,以FITC标记的抗TNF-α、IL-6、Ikkβ抗体采用细胞膜表面标志及胞内因子四重染色,流式细胞术检测活化血小板对单核细胞亚群的比例、增殖和胞内促炎细胞因子产生的作用,并采用明胶酶谱法观察促进MMP的产生的作用。其次,使用抗CD147m Ab、Ikk抑制剂进行阻断试验,采用流式细胞术检测抗体阻断后活化血小板对单核细胞亚群的作用。进而明确CD147是否通过NF-κB信号通路参与上述活化血小板对单核细胞的作用。结果:1.类风湿关节炎患者血小板的活化以及CD147的表达RA患者外周血血小板表面的标记(PAC-1,CD62P,CD40L和CD147)均较健康对照组明显升高(Active or Inactive RA,P<0.01),特别是在活动的RA患者组升高尤为明显(Active RA vs HD,P<0.01),具有统计学差异。而这四种标记中又以CD147的表达水平增高最为显著。用DAS-28评分衡量患者病情活动度,并与血小板表面活化标记(PAC-1,CD62P和CD147)进行相关性分析显示呈显著的正相关(r=0.497,r=0.57和r=0.63;P<0.01)。研究揭示,RA患者外周血中血小板处于高度活化状态并高表达CD147分子,而且血小板活化和表达CD147的程度与疾病的活动度呈正相关。2.RA单核细胞亚群的比例、CD147分子和胞内因子的表达RA患者外周血中Mon1亚群的比例较对照组降低(Active or Inactive RA vs HD,P<0.01),Mon2、Mon3亚群的比例较对照组均增高(Active or Inactive RA vs HD,P<0.05),其中尤以Mon2亚群升高的比例最为显著(Active or Inactive RA vs HD,P<0.001),而且在这三组对象中,活动的RA患者外周血Mon2亚群的比例较对照组升高最为明显(Active RA vs HD,P<0.001)。CD147在RA患者外周血单核细胞的三个亚群中均高表达(Active or Inactive RA vs HD,P<0.01),且以活动RA患者外周血Mon2亚群上CD147表达水平升高最为显著(Active RA vs HD,P<0.001),同时该群细胞表达TNF-a和IL-6的水平也显著升高(Active RA vs HD,P<0.001)。研究揭示,RA患者外周血中单核细胞Mon2亚群比例的升高,CD147和细胞因子的高表达提示Mon2亚群具有较强的迁移、侵袭和促炎功能,由此可能在RA的发病过程中占据主导作用。3.RA外周血中血小板与单核细胞的聚集(MPA)情况MPA的水平在RA患者外周血中显著升高(Active or Inactive RA vs HD,P<0.001),尤其是在活动RA组尤为明显(Active RA vs HD,P<0.001)。进一步分析血小板与单核细胞各个亚群的聚集发现,MPA水平在各个亚群都有所升高(Active or Inactive RA vs HD,P<0.001),特别是在活动期的RA患者组(Active RA vs HD,P<0.001),这其中又以Mon2群升高更为明显。活动期RA患者外周血中MPA水平与血小板上CD147的表达、Mon2亚群比例和Mon2亚群上CD147的表达进行相关性分析显示呈显著的正相关(r=0.61,r=0.66和r=0.77;),而在与健康对照以及其他两个亚群的相关性分析中并没有统计学差异。研究表明,RA患者外周血中血小板与单核细胞的聚集增多主要是源自于血小板与单核细胞Mon2亚群的聚集增加所致,并由此推测RA患者外周血血小板上高表达的CD147和Mon2亚群上高表达的CD147通过同型配体之间的相互作用在二者的聚集以及血小板对单核细胞亚群的作用中发挥重要的作用。4.活化血小板对单核细胞亚群的作用RA患者的血小板与单核细胞接触共培养组Mon2亚群的比例明显高于其他分组(P<0.01)。其次,CD147单抗阻断组和非接触共培养组Mon2亚群的比例较共培养组低(P<0.01)。此外,我们用Brd U流式试剂盒检测了以上分组中单核细胞亚群Brd U的水平,统计分析发现接触共培养组Mon2亚群的Brd U表达较其他组升高(P<0.05),说明这群细胞的增殖力旺盛。同样的分组,我们检测单核细胞各个亚群胞内因子的表达,发现RA的血小板与单核细胞接触共培养组胞内IL-6和TNF-α的水平明显高于其他分组(P<0.01)。而且,胞内因子IL-6和TNF-α的水平主要在Mon2群细胞表达升高明显,在另外两群中表达较低尤其是对Mon1群细胞的表达几乎无影响。通此外,通过检测胞内Ikkβ的表达水平发现接触共培养组Mon2亚群的表达水平最高(P<0.01),明胶酶谱实验也得到了类似的结果。应用CD147m Ab和Ikk阻断二者的相互作用发现单核细胞Mon2亚群的比例、增殖能力、与血小板的聚集、胞内因子的分泌以及MMP-9的表达均呈现不同程度的抑制作用。通过我们的研究结果说明CD147分子参与血小板促进单核细胞亚群的分化、增殖、侵袭以及发挥促炎作用,并且该作用是通过活化NF-κB信号通路实现的。结论:本课题研究结果显示RA患者外周血的血小板呈活化状态,可高表达CD147分子,并且与疾病活动度呈正相关性;RA患者外周血中的三个单核细胞亚群以Mon2亚群比例升高为主,且高表达CD147分子;血小板三个单核细胞亚群中血小板与单核细胞形成的聚集物水平在RA中显著增多,且该聚集水平与血小板的活化、Mon2亚群的比例以及高表达的CD147均呈正相关关系;RA患者外周血的血小板与单核细胞通过直接接触作用影响单核细胞亚群,尤其是Mon2亚群的分布比例、增殖,胞内因子的分泌和MMP的表达,并且阻断CD147分子对上述效应均有显著抑制作用,说明活化血小板上高表达的CD147对单核细胞亚群尤其是发挥促炎作用的Mon2群的分化中发挥了重要作用,其次,通过对细胞内Ikkβ表达的分析以及阻断Ikk通路无论是从表型还是转录因子水平上均可以显著抑制单核细胞亚群的增殖、分化以及活化,由此推断血小板与单核细胞直接接触的相互作用是通过NF-k B通路所介导的。通过本课题的研究,阐明血小板活化及其对单核细胞亚群调控在RA发病中的作用,拟在探索该类疾病早期诊断及预后的新指标,为临床治疗提供理论依据和治疗靶点。